Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

3.Физиологические особенности микроорганизмов, учитываемые при со-

здании элективных условий выращивания.

4.Свойства сенной палочки, картофельной палочки, протея, уксуснокис-

лых бактерий, дрожжей, галофилов, положенные в основу получения накопительных культур.

План занятия:

1.Ознакомление с теоретическими вопросами по теме «Биохимическая деятельность микроорганизмов».

2.Изучение методов накопления культур гнилостных, уксуснокислых бактерий, галофилов, дрожжей.

3.Самостоятельная работа.

Пояснение к занятию

Микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью,

благодаря чему они осуществляют кругооборот веществ в природе. Мно-

гие продукты их жизнедеятельности полезны для человека и широко ис-

пользуются в народном хозяйстве (например, антибиотики, витамины,

аминокислоты, ферменты, спирты – этиловый, бутиловый, органические кислоты – молочная, масляная, ацетон и др.). Наряду с этим биохимиче-

ская деятельность микроорганизмов, развивающихся на различных суб-

стратах, может вызвать различные процессы порчи, например, гнилостные процессы под влиянием микробов, способных к расщеплению белка, про-

цессы брожения под влиянием микробов, расщепляющих углеводы, про-

цессы расщепления жира под влиянием микроорганизмов с липолитиче-

ской активностью. На занятиях по данной теме студенты знакомятся с микроорганизмами, наиболее часто вызывающими порчу пищевых про-

дуктов: возбудителями гнилостных (протей, сенная палочка, галофилы) и

бродильных (уксуснокислые, дрожжи) процессов.

31

Эти микроорганизмы изучаются на занятиях в виде элективных

(накопительных) культур, что позволяет одновременно знакомиться с важ-

ным приемом качественного анализа микрофлоры – получением электив-

ных культур.

Элективной (накопительной или избирательной) называется культу-

ра, обогащенная одним определенным видом или определенной физиоло-

гически родственной группой микроорганизмов. По преобладающим мик-

роорганизмам получает название вся культура. Для получения таких куль-

тур необходимо создать элективные условия, обеспечивающие преимуще-

ственное развитие определенной группы или вида микроорганизмов. Эти условия учитывают особенности физиологии и обмена веществ микроор-

ганизмов: требования их к источникам питания, отношение к кислотности среды, аэрации, температуре и др. Особенно часто элективные условия со-

здают путем подбора соответствующей для выявленных микроорганизмов среды. Это так называемые элективные или накопительные среды. Элек-

тивная среда в наибольшей степени отвечает по составу и свойствам (рН,

содержание соли) требованиям выделяемого микроорганизма.

Одновременно стремятся создать для конкурирующих видов небла-

гоприятные или совсем невыносимые условия. В результате нужный вид,

даже если в исследуемом материале были единичные клетки его, через определенное время выращивания становится преобладающим вследствие более высокого темпа размножения.

Этим методом пользуются для качественного анализа микрофлоры различных объектов при выделении чистых культур микробов, которые содержатся в исследуемых субстратах в малых количествах и не могут быть выделены чашечным методом Коха.

В производственных процессах широко используются накопитель-

ные культуры, например, в хлебопечении –элективные культуры дрожжей.

32

Лабораторная работа по получению и изучению накопительных культур наиболее распространенных возбудителей порчи пищевых про-

дуктов, а также некоторых видов, используемых в пищевой промышленно-

сти, выполняется на двух занятиях: на первом производится посев матери-

ала, содержащего заданную культуру, на втором – анализируется результат опыта. Каждый студент (или группа из 2 человек) выделяет и анализирует две элективные культуры, одна из которых – элективная культура карто-

фельной палочки, другая – по выбору.

Самостоятельная работа

1.Получение элективной культуры уксуснокислых бактерий.

2.Получение элективных культур гнилостных бактерий (сенной палочки,

картофельной палочки), протея.

3.Получение элективной культуры дрожжей.

4.Получение элективной культуры галофильных микроорганизмов.

Задача 1. Получение элективной культуры уксуснокислых бактерий

Уксуснокислые бактерии вызывают процесс уксуснокислого броже-

ния, который заключается в окислении этилового спирта до уксусной кис-

лоты и воды:

C2H5OH + O2 → CH3COOH + H2O + энергия

Эти бактерии широко распространены в природе и встречаются на зрелых плодах, ягодах, в квашеных овощах, закисшем вине и пиве. Уксус-

нокислые бактерии – мелкие палочки, спор не образуют, одни из них непо-

движные, другие подвижные. Они сапрофиты, аэробы, многие образуют пленки на поверхности жидкости, содержащей спирт. Оптимальная темпе-

ратура их развития 25–35 °С.

По сравнению со многими другими бактериями они обладают боль-

шой устойчивостью к уксусной кислоте и этиловому спирту. Это их свой-

ство используется для получения элективной культуры.

33

Методические указания

В две конические колбочки объемом 50 мл налить тонким слоем

(1–1,5 см) питательную среду – непастеризованное пиво. В одну колбочку добавить 1 мл 5 % уксусной кислоты. Подкисление среды не будет препят-

ствовать развитию уксуснокислых бактерий, но будет ограничивать рост посторонней микрофлоры, например некоторых дрожжей, которые могут также развиваться в пиве. В другой колбочке пиво уксусной кислотой не подкислять. Пометить колбу, в которую добавлена кислота. Колбочки за-

крыть ватными пробками, подписать и поместить в термостат при

25–30 °С.

Последовательность проведения опыта записать.

Задача 2. Получение элективных культур гнилостных бактерий

(сенной палочки, картофельной палочки, протея)

Гниением называется сложный биохимический процесс разложения белковых веществ микроорганизмами. Видовой состав гнилостных бакте-

рий чрезвычайно разнообразен: среди них есть спорообразующие и не об-

разующие спор, аэробные и анаэробные виды, подвижные и неподвижные,

расщепляющие белки до полной минерализации и образующие продукты неполного распада белка. Среди продуктов распада белковых веществ об-

наруживаются аминокислоты, органические кислоты, спирты, сероводо-

род, углекислый газ, аммиак, амины, меркаптаны, скатол, индол и целый ряд других веществ.

Гнилостные бактерии широко распространены в природе и на раз-

личных пищевых продуктах. Видовой состав этой группы бактерий разно-

образен. Есть аэробы и анаэробы, сбраживающие углеводы и не сбражи-

вающие их, спорообразующие и не образующие спор бактерии, подвижные и неподвижные. Развитие гнилостных бактерий на продуктах, богатых белками, обусловливает их порчу.

34

На лабораторных занятиях выделяются элективные культуры трех видов гнилостных бактерий: сенной, картофельной палочек и протея.

Сенная палочка (Bac. subtilis) является распространенным возбуди-

телем гниения. Естественное место ее обитания – сено. Сенная палочка,

размножаясь в продуктах, богатых белками, вызывает их гниение. Она способна расщеплять также углеводы, поэтому вызывает порчу раститель-

ных и хлебобулочных изделий. Сенная палочка может развиваться на очень бедных питательных средах. Это аэробная, крупная, спорообразую-

щая подвижная палочка, часто соединенная в цепочки; окрашивается по Граму положительно. Оптимальная температура ее роста 20–30 °С. Харак-

терными признаками сенной палочки являются подвижность клеток, со-

держащих споры, и высокая термостойкость спор (выдерживает кипячение до 3 ч). В сене содержатся помимо сенной палочки и другие виды бакте-

рий, однако ни одна из культур не обладает такой термостойкостью.

Выделение сенной палочки основано на следующих ее особенностях:

аэробном дыхании, способности роста на бедных средах, термоустойчиво-

сти спор.

Картофельная палочка (Bac. mesentericus) широко распространена в природе, постоянно встречается на картофеле, попадая на него из почвы, и

на других продуктах. Это подвижная, спорообразующая палочка. Карто-

фельная палочка – сапрофит, аэроб; оптимальная температура ее развития

30–45 °С, на вареном картофеле эта бактерия растет в виде складчатого крупноили мелкоморщинистого налета коричневого цвета. Получение элективной культуры картофельной палочки основано на термоустойчиво-

сти спор и специфичности применяемой питательной среды.

Протей – Proteus vulgaris (Bact. vulgare) широко распространен в природе, постоянно встречается в гниющих белковых продуктах. Он энер-

гично разлагает белки с образованием дурно пахнущих продуктов – индо-

ла, скатола, сероводорода. Сбраживает углеводы с образованием кислот и

35

газов – углекислого и водорода. Относится к сапрофитам, факультативным анаэробам, имеет форму мелких палочек, не образует спор, не окрашивает-

ся по Граму. Оптимальная температура развития 37 °С, но он хорошо раз-

вивается и при 25 °С.

Характерной особенностью протея является чрезвычайная его по-

движность. Последнее свойство используют для получения накопительной культуры протея – отделения его от сопутствующих бактерий, а также для выявления присутствия протея в пищевых (мясных, рыбных) продуктах

(метод Шукевича). Некоторые разновидности протея способны вырабаты-

вать токсин. Потребление продукта, в котором размножились эти бакте-

рии, может вызвать отравление.

Методические указания

Для получения накопительной культуры Bacillus subtilis поместить примерно 1 г сена в колбу и залить 15–20 мл водопроводной воды с темпе-

ратурой 40–50 ° С. Сено настаивают в течение 30 мин. За это время из сена экстрагируются вещества, которые будут являться питательным материа-

лом для развития бактерий. Через 30 мин сенной настой (без сена) пере-

лить в другую колбу, закрыть ватной пробкой и поместить в кипящую ба-

ню на 30–40 мин.

За это время вегетативные клетки и споры большинства бактерий по-

гибнут. Лишь споры некоторых бактерий, и в том числе споры Bac. subtilis,

устойчивые к нагреванию, останутся жизнеспособными и смогут разви-

ваться при благоприятных условиях. По окончании нагревания пробирки поставить в термостат на 30 °С на 48–72 ч. Пробки при этом не открывать!

В таких условиях не развиваются анаэробы, микроорганизмы, нуждающи-

еся в богатой питательной среде, а также нетермоустойчивые микроорга-

низмы.

Последовательность проведения опыта записать.

36

Задача 3. Получение накопительной культуры картофельной палочки (выполняется всеми)

Для постановки накопительной культуры картофельной палочки бе-

рут клубни картофеля, моют водопроводной водой, нарезают скальпелем на мелкие кубики. Примерно 1,5–2 г нарезанного картофеля переносят в две пробирки, добавляют в одну из них 0,5 г мела и заливают обе пробирки водопроводной водой. Уровень воды не должен доходить до края пробир-

ки на 2–2,5 см.

Приготовленные таким образом пробирки закрывают ватными проб-

ками и подвергают пастеризации на водяной бане (при температуре 80 °С, 10 мин). Время нагрева культуры до температуры пастеризации определя-

ют по контрольной пробирке с термометром. После окончания пастериза-

ции культуру помещают в термостат на 30 °С.

Для изучения культуральных свойств колонии картофельной палоч-

ки отрезать 1–2 ломтика картофеля толщиной 1 см и со всех сторон нате-

реть его мелом для нейтрализации кислот клеточного сока. Ломтики поме-

стить в чашку Петри, прогреть чашку на сетке водяной бани в течение

10 мин, охладить, подписать и поместить в термостат на 30 °С.

Последовательность проведения опытов записать.

Задача 4. Получение накопительной культуры протея

1. Приготовить две пробирки со «скошенным» мясопептонным ага-

ром. Для этого пробирки с МПА помещают в кипящую водяную баню. По-

сле расплавления питательной среды пробирки кладут в наклонном поло-

жении для застывания агара.

Наклеить на пробирки этикетки с указанием фамилии студента и но-

мера группы.

37

2. В конденсационную воду одной пробирки (№ 1) опустить кусочек несвежего мяса величиной с пшеничное зерно. Опустить надо, не касаясь поверхности агара во избежание заражения его микроорганизмами мяса. Для этого пробирку со «скошенным» агаром держат в горизонтальном положении так, чтобы агар находился сверху. Кусочек мяса взять пинцетом и поместить на нижнюю стенку пробирки, протолкнуть его бактериологической иглой почти до дна пробирки в конденсационную воду. Пробирку закрыть ватной пробкой и в вертикальном положении поставить в термостат при 25–35 °С.

Во вторую пробирку (№ 2) мясо не вносить и сохранить ее в холодильнике для последующей работы.

3.Через сутки на «скошенном» МПА в пробирке № 1 разовьются бактерии. Протей благодаря активной подвижности будет быстрее других ползти по поверхности «скошенного» агара, образуя в верхней части его характерный нежный голубовато-серый стелющийся налет. Необходимо из самой верхней части налета сделать пересев бактерий (бактериологической петлей) в конденсационную воду «скошенного» агара пробирки № 2, не касаясь поверхности агара. Пробирку поставить в термостат при 25 °С. Пробирка № 1 с культурой протея больше не используется.

4.Последовательность проведения опыта записать.

Задача 5. Получение элективной культуры дрожжей

Многие дрожжи являются возбудителями спиртового брожения – процесса разложения сахара с образованием этилового спирта и углекислого газа:

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + энергия.

Дрожжи являются сапрофитами. Среди них есть факультативные анаэробы и аэробы. Оптимальная температура их развития 25–30 °С, оптимальное значение рН среды 4–6. Они широко распространены в природе,

38

встречаются в плодах, ягодах и других сахаросодержащих продуктах и мо-

гут вызвать их порчу (забраживание).

Получение элективной культуры дрожжей основано на их способно-

сти расти в сахаросодержащих субстратах со слабокислой реакцией и на их устойчивости к этиловому спирту.

Методические указания

В бродильную пробирку (пробирку с поплавком) со стерильным сус-

лом внести пинцетом 2–3 ягоды (виноград, изюм).

Пробирку закрыть ватной пробкой, подписать и поместить в термо-

стат при 25–30°С.

Последовательность проведения опыта записать.

Задача 6. Получение элективных культур

галофильных микроорганизмов

Галофильными микроорганизмами называют микроорганизмы, раз-

вивающиеся на субстратах с повышенным содержанием поваренной соли

(NaCl).

Галофильные бактерии разнообразны. Среди них есть шаровидные и палочковидные, подвижные и неподвижные, спорообразующие и не обра-

зующие спор, аэробы и анаэробы. Постоянное место их обитания – соле-

ные продукты, поваренная соль, вода соленых водоемов. Получение элек-

тивных культур галофилов основано на их солелюбии, или солеустойчиво-

сти.

Методические указания

1. В три пробирки с мясо-пептонным бульоном, содержащим в одной пробирке 10 % NaCl, в другой – 15 % NaCl и в третьей без NaCl, внести с помощью бактериологической иглы по кусочку соленой сельди размером

39

со спичечную головку. Пробирки закрыть ватными пробками. Наклеить на пробирки этикетки с указанием фамилии студента, номера группы.

2.Поместить пробирки в термостат при 25–30 °С.

3.Последовательность проведения опыта записать.

Занятие 13. Количественный учет микроорганизмов прямым

счетом на фиксированных мазках. Анализ элективных культур

Цель занятия: изучение свойств микробов возбудителей гнилостных и бродильных процессов, полученных в накопительной культуре (иссле-

дуются посевы, выполненные на предыдущем занятии); освоение метода количественного учета микроорганизмов прямым счетом на фиксирован-

ных мазках.

Вопросы для обсуждения:

1.Понятие «элективная культура» и способы ее получения.

2.Практическое значение метода элективного культивирования микроор-

ганизмов.

3.Уксуснокислое брожение и его значение для уксуснокислых бактерий.

4.Морфологические особенности уксуснокислых бактерий (форма клетки,

подвижность, способность к спорообразованию).

5.Тип питания и тип дыхания уксуснокислых бактерий.

6.Способ обнаружения уксусной кислоты, образуемой уксуснокислыми бактериями.

7.Какие условия постановки опыта способствуют накоплению в среде ук-

суснокислых бактерий и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?

8.Какова роль уксуснокислых бактерий в процессе порчи пищевых про-

дуктов?

40