Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

пуклые, диаметром 2–4 мм. На висмут-сульфитном агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, среда под колониями окрашена в черный цвет или колонии зеленовато-бурые, светло-зеленые, коричневые и т. п.

Под микроскопом –грамотрицательные неспоровые палочки. Подо-

зрительные колонии пересевают (каждую отдельно) на скошенный в про-

бирках МПА с 0,1%-м раствором глюкозы и выращивают при 37 °С 24 ч.

Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на среды для идентификации энтеробактерий:

а) среда с глюкозой и феноловым красным;

б) среда с нитратом калия.

Энтеробактерии ферментируют глюкозу, среда при этом из красной становится желтой. Они способны восстанавливать нитраты в нитриты и не имеют фермента цитохромоксидазы. Если в образце обнаружены гра-

мотрицательные неспоровые палочки, которые дают отрицательную реак-

цию на цитохромооксидазу, ферментируют глюкозу и восстанавливают нитраты в нитриты, исследуемый препарат содержит бактерии семейства

Enterobacteriacese.

Определение бактерий S. aureus и P. аeruginosа. 10 г (мл) образца вносят в 90 мл накопительной среды, инкубируют при 37°С 24–48 ч. При наличии роста делают пересев петлей на чашки Петри с солевым агаром с маннитом и на чашки со средой для идентификации P. аeruginosа. Инку-

бируют при 37°С 24–48 ч.

S. aureus на солевом агаре с маннитом образует желтые колонии,

окруженные желтыми зонами. При микроскопии обнаруживаются грампо-

ложительные кокки. С чистой культурой стафилококка ставят реакцию ко-

агуляции плазмы. Для этого 8 мл свежеполученной крови человека или кролика смешивают с 2 мл 5%-го раствора цитрата натрия, тщательно пе-

ремешивают и центрифугируют. Полученную плазму разводят 1:4

81

0,9%-м раствором хлорида натрия и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В каждую пробирку вводят петлю агаровой культуры стафи-

лококка и инкубируют при 37 °С. Результаты учитывают через

1–24 часа.

S. aureus коагулирует плазму. P. аeruginosа на диагностической сре-

де образует зеленоватые флюоресцирующие колонии грамотрицательных палочек, которые выделяют в среду сине-зеленый пигмент и дают положи-

тельную реакцию на цитохромоксидазу.

Задача 4. Определение микробной загрязненности лекарственных средств, обладающих бактерицидным действием, включая антибио-

тики. Способы устранения антимикробного действия лекарственных средств

Для инактивации пенициллинов и цефалоспоранов в буферный рас-

твор, используемый для растворения или суспендирования образца, а так-

же в среды, используемые для посева образца, перед их употреблением асептически вносят пенициллиназу из расчета 1000 ЕД на 1 мл среды для пенициллинов и 50000–100000 ЕД на 1 мл среды для цефалоспоринов. Пе-

ред внесением пенициллиназы в питательный агар его расплавляют и охлаждают до 50 °С. Для инактивации тетрациклинов в питательные сре-

ды, используемые для засева образца, во время их приготовления вносят

10% сульфата магния MgSO4·7H2O.

Для инактивации сульфаниламидных препаратов в буферный рас-

твор и в питательные среды во время их приготовления вносят пара-

аминобензойную кислоту из расчета 0,05 г на 1 л среды.

Растворы для анализа. 1 л 0,5%-го раствора антибиотика или 10 %

суспензии из таблеток, содержащих антибиотик. Суспензию из таблеток приготавливают путем их растирания в стерильных фарфоровых ступках.

Для феноксиметилпенициллина, ампициллина тригидрата, тетрациклина,

82

олеандомицина фосфата растворителем является 1/15 М фосфатный буфер рН 7,8–8,0, для оксациллина и диклоксациллина – 0,9%-й раствор хлорида натрия. Критерием для выбора растворителя является скорость растворе-

ния препарата и отсутствие антимикробных свойств у самого раствори-

теля.

Питательные среды. МПА, среда Сабуро, среда Эндо, кровяной агар. Стерильные среды разливают в чашки Петри.

Постановка опыта. Раствор антибиотика немедленно после приго-

товления фильтруют через 4 мембранных фильтра по 250 мл раствора че-

рез каждый фильтр. После фильтрации фильтры отмывают от антибиотика пятью порциями растворителя по 100 мл. Фильтры помещают в чашки Петри на следующие среды:

а) для определения общего количества микроорганизмов – на МПА.

В МПА добавляют инактиваторы (см. с. 33). Посевы инкубируют при

37° С 3 суток;

б) для определения общего количества плесневых и дрожжевых гри-

бов – на среду Сабуро. Инкубируют при 24 °С 5 суток;

в) для определения микроорганизмов кишечной группы – на среду Эндо, в среду добавляют инактиваторы, как и в МПА. Инкубирует при

37 °С 3 суток;

г) для обнаружения патогенных стафилококков – на кровяной агар, куда добавляют инактиваторы. Инкубируют при 37 °С 3 суток. На кровяном агаре патогенные стафилококки вокруг колоний дают зону гемолиза.

Суспензии из таблеток антибиотиков высевают непосредственно по

0,2 мл на поверхности агаризованных сред сплошным посевом шпателем,

используя параллельно 3 чашки Петри. Результаты определения оформля-

ют в виде табличной формы:

83

Делают заключение о микробной загрязненности лекарственных

средств.

Оформить протокол исследования.

84

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Рецепты красителей, используемых на лабораторных занятиях

Окраска по Романовскому–Гимзе

Метод широко используют в микробиологии для изучения строения клетки, например ядра. Кроме того, он является одним из основных мето-

дов при изучении морфологии простейших, спирохет и риккетсий. Краси-

тель Романовского–Гимзы представляет собой смесь азура, эозина и мети-

ленового синего. Краска продается в готовом виде. Непосредственно перед окраской мазка готовят рабочий раствор краски, состоящий из 10 мл ди-

стиллированной воды (рН 7,0) и 10 капель краски. Фиксированный мазок опускают в стакан с раствором красителя мазком вниз на 1 час. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе; микроско-

пируют в иммерсионной системе.

Фуксин

Насыщенный спиртовый раствор фуксина основного: фуксин основ-

ной – 10 г; этанол 96%-й – 100 мл.

Основной карболовый фуксин Циля: 5%-й водный раствор свежепе-

регнанного фенола – 100 мл, насыщенный спиртовый раствор фуксина ос-

новного – 10 мл. Приготовленную смесь через 48 ч отфильтровывают.

Краситель отличается устойчивостью.

Водный фуксин: карболовый фуксин Циля – 1 мл, дистиллированная вода – 9 мл. Водный фуксин нестоек, поэтому его готовят непосредственно перед употреблением.

85

Метиленовый синий

Насыщенный раствор метиленового синего: метиленовая синь – 2 г,

этанол 96 % – 100 мл. Раствор оставляют на 2–3 дня, несколько раз взбал-

тывают, после чего фильтруют. Раствор устойчив.

Метиленовый синий Леффлера: 30 мл насыщенного раствора мети-

ленового синего смешивают с 1 мл 1%-го раствора едкого калия и дистил-

лированной водой доводят объем до 100 мл.

Генциановый фиолетовый

Раствор А: генциановый фиолетовый – 1 г, этиловый спирт – 10 мл.

Раствор Б: 1%-й водный раствор свежеперегнанного фенола –

100 мл.

После полного растворения генциан-фиолета растворы А и Б смеши-

вают. Полоски фильтровальной бумаги пропитывают красителем и высу-

шивают.

Раствор Люголя (в модификации Грама). Кристаллический йод – 1 г,

йодистый калий – 2 г, дистиллированная вода – 300 мл.

Судан III. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96%-го спирта или концентрированной молочной кислоты.

86

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Питательные среды, используемые на лабораторных занятиях

1. Простые среды

Мясопептонный бульон (МПБ) – жидкая среда для выращивания бактерий. Для приготовления мясной воды свежее мясо (без костей и су-

хожилий) измельчают в мясорубке, заливают двойным количеством водо-

проводной воды и нагревают 30 мин на слабом огне до температуры воды

50 °С, а затем кипятят в течение часа. Отфильтрованную через ткань массу доводят водой до первоначального объема. К полученной мясной воде до-

бавляют 1 % пептона и 0,5 % NaCl. Смесь фильтруют, охлаждают, подще-

лачивают 10%-м раствором соды до рН 7,2. Для осветления к бульону до-

бавляют взбитый белок куриного яйца. смесь нагревают до 100 °С и кипя-

тят 20 мин. Горячий бульон фильтруют, разливают в различные емкости и стерилизуют 20 мин в автоклаве при 120 °С.

МПБ является средой, богатой питательными веществами, но почти не содержит углеводов. Поэтому для выращивания более требовательных бактерий готовят так называемый сахарный бульон, добавляя к МПБ

1–2 % углеводов.

Мясопептонный агар (МПА) – плотная среда. Для приготовления ее добавляют в МПБ 2 % измельченного агара, смесь расплавляют при нагре-

вании, устанавливают рН 7–7,2, фильтруют, разливают по емкостям (про-

бирки, колбы и др.) и стерилизуют 30 мин при 120 °С в автоклаве.

Мясопептонная желатина (МПЖ). В 1 л МПБ помещают 100–150 г

желатины. Температура плавления желатины зависит от ее содержания в среде: в случае 10%-й концентрации в среде она плавится при 24 °С; в слу-

чае 15%-й – при 25°С. В летнее время среды готовят, добавляя 15 % жела-

тины.

87

После растворения желатины при осторожном нагревании устанав-

ливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5

мин, затем охлаждают до 40–50 °С. Взбитый с небольшим количеством воды яичный белок вливают в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха теку-

чим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 часа.

Солодовое сусло – жидкая среда для плесневых грибов и дрожжей, а

также многих ацидофильных бактерий (молочнокислых, уксуснокислых).

Для приготовления сусла берут 250 г пророщенного ячменя, измельчают его, заливают 1 л воды и выдерживают при температуре 55–58°С до исчез-

новения реакции на крахмал(синего окрашивания с йодом. При этом под влиянием ферментов зерна происходит осахаривание крахмала и гидролиз белков до аминокислот и полипептидов. Смесь фильтруют и определяют содержание сахара сахариметром Беллинга, градусы (°Б) которого соот-

ветствуют содержанию сахара в сусле. До нужной крепости его разбавля-

ют водопроводной водой (для грибов – до 3–4 °Б, для дрожжей – 8 °Б, для молочнокислых бактерий – 8–12 °Б). Стерилизуют солодовое сусло паром при 0,5 атм 20–30 мин или дробно 3 дня по 10 мин текучим паром.

Сусло-агар (СА) – плотная среда. Готовят ее путем добавления к со-

лодовому суслу 2-2,5 % агара. Расплавляют агар при нагревании, горячий раствор фильтруют через вату, разливают в емкости и стерилизуют 30 мин при 120 °С.

Среда Сабуро (для культивирования дрожжевых и мицелиальных грибов). Пептон – 10 г, глюкоза – 40 г, агар – 20 г, вода дистиллированная до 1000 мл. Стерилизуют 30 мин при 115 °С (давление 0,5 атм).

Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищенного и про-

мытого водой картофеля, заливают 1 л водопроводной воды, варят 30 мин.

88

Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объе-

ма. К полученной жидкости прибавляют 2 % агара, кипятят до его рас-

плавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред ис-

пользуют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке не-

благоприятно влияет на рост некоторых микроорганизмов. Обрат получа-

ют сепарированием молока, нагретого до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока.

Молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может карамелизо-

ваться.

Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдер-

живают в автоклаве при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. Перед стерили-

зацией кислотность обрата не должна превышать 22 °Тернера (°T), иначе молоко свернется. После стерилизации его выдерживают 3 суток в термо-

стате при 30 °С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и дру-

гих стойких к нагреванию форм. Через 3 суток пробирки с молоком про-

сматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают.

При стерилизации в автоклаве иногда возможно побурение молока вследствие карамелизации молочного сахара и пептонизации казеина. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, кото-

рый может частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Дрожжевые среды.

Дрожжевая вода. 50–100 г сухих дрожжей разводят в 1 л воды, ки-

пятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней ежедневно.

89

Дрожжевой автолизат. 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л

воды; добавляют 2 г Na2HPO4, каплями 1 н раствор NaOH до (рН 6,1) и 5

мл хлороформа, выдерживают при 37 °С 2 суток, доводят раствором NaOH

до рН 7,4, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют при 115°С 30 мин.

Дрожжевой экстракт. 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л

воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115 °С 30 мин.

90