Микробиология. Часть II. Учебно-методическое пособие

План занятия:

1.Ознакомление с теоретическими вопросами по теме (учебник).

2.Самостоятельная работа: изучение антимикробного действия темпе-

ратуры среды, рН, осмотического давления среды, антисептиков и фитон-

цидов (посев микроорганизмов после воздействия фактора внешней среды или выращивание культуры при постоянном воздействии исследуемого фактора).

Пояснение к занятию

Условия обитания оказывают постоянное влияние на микробную клетку.

Внешняя среда является мощным фактором изменчивости и эволюции микроорганизмов. Знание результатов воздействия внешних факторов на микроорганизмы позволяет ускорять выращивание полезных форм, повы-

шать интенсивность микробиологических процессов, используемых в про-

мышленности, осуществлять эффективные меры профилактики и лечения инфекционных заболеваний микробной природы, удлинять сроки хранения пищевых продуктов путем подавления развития возбудителей микробной порчи.

На занятиях по данной теме студенты знакомятся с методами регули-

рования жизнедеятельности микроорганизмов путем воздействия на них физических, химических и биологических факторов внешней среды. Ис-

следуются факторы внешней среды, используемые для консервирования пищевых продуктов, – высокая температура, повышенное осмотическое давление, кислотность среды, антисептики и антибиотики.

Влияние того или иного фактора изучают путем выращивания микро-

организмов при воздействии или после воздействия исследуемого фактора;

результат влияния определяют по интенсивности роста микроорганизмов в питательных средах, а в ряде случаев – по их ферментативной активности по сравнению с контрольной культурой.

51

Следует подчеркнуть, что результат внешних воздействий на микроб-

ную клетку зависит от механизма и длительности действия фактора, видо-

вой устойчивости микроорганизмов, интенсивности воздействия (дозы,

концентрации), а также от физических и химических условий среды.

В микробиологической практике интенсивность роста микроорганиз-

мов часто выражают ориентировочными визуальными показателями: на жидких средах – степенью помутнения, на агаризованных – плотностью роста культуры. Для более точной оценки пользуются количественными методами: подсчетом числа клеток в единице объема среды (непосред-

ственно под микроскопом или по количеству выросших колоний), а также определением общей биомассы культуры в единице объема среды. Лабора-

торная работа по изучению влияния факторов внешней среды на развитие микроорганизмов выполняется на двух занятиях: на первом занятии пово-

дится посев микроорганизмов и выращивание после или при воздействии исследуемого фактора внешней среды, а на втором занятии анализируется результат. Каждый студент исследует антимикробное действие одного из предложенных для изучения факторов внешней среды.

Методы подавления жизнедеятельности

вредных для человека микроорганизмов

Температура среды

Температура среды, неблагоприятная для роста микроорганизмов, –

один из факторов, которые широко используются на практике для подав-

ления жизнедеятельности микроорганизмов. Наибольшая температура, при которой возможно развитие микробов, называется максимальной.

Большинство микроорганизмов плохо переносит превышение макси-

мальной температуры развития. Уже при 56-60 °С возможна тепловая коа-

гуляция белка, при которой клетка погибает. Термоустойчивость микробов различна в зависимости от видовых особенностей и формы жизнедеятель-

52

ности: вегетативные клетки погибают быстрее, споровые сохраняются дольше. Так, бесспоровые бактерии, вегетативные клетки споровых бакте-

рий, мицелиальные грибы и дрожжи погибают при температуре 60-70 °С в течение 15-30 мин, а при 80–100 °С – в течение нескольких секунд или

1–3 мин. Споры микроскопических грибов погибают при 65–80 °С, споры многих бактерий значительно более устойчивы: они погибают при нагре-

вании до 80–100 °С в течение нескольких часов, а при автоклавировании при температуре 120 °С – в течение 20 мин. Термостойкость микроорга-

низмов, помимо особенностей вида, зависит от возраста клеток, химиче-

ского состава среды, кислотности и других факторов.

Самостоятельная работа

1.Воздействие высоких температур на бесспоровые бактерии.

2.Воздействие высоких температур на споровые бактерии.

3.Воздействие высоких температур на мицелиальные грибы.

4.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Бесспоровые бактерии

Водяную баню нагревают до температуры 80 °С. Чашку Петри с за-

стывшим мясопептонным агаром, расчерчивают со стороны дна на три сектора, которые обозначают по времени прогревания культуры (0–10–30).

Делают посев заготовленной заранее взвеси бесспоровых бактерий (в фи-

зиологическом растворе – раствор NaCl 0,85 %) бактериологической пет-

лей на сектор 0, т. е. без прогрева. Посев производится методом штриха на поверхности агара. Пробирку с культурой помещают в водяную баню и прогревают 10 мин, после чего производят посев культуры на сектор 10.

Вновь помещают пробирку в водяную баню, прогревают дополнительно

20 мин и высевают культуру на сектор 30 (общее время прогрева культу-

53

ры). Чашки помещают в термостат для выращивания при температуре

37 °С.

Задача 2. Споровые бактерии

Термостойкость этих бактерий определяют аналогично определению термостойкости бесспоровых бактерий.

Задача 3. Мицелиальные грибы

Ранее заготовленные чашки Петри с застывшим суслом-агаром надписывают со стороны дна – 5, 25, 40 (обозначения соответствуют тем-

пературе выращивания гриба) и перевертывают чашки крышкой вверх. Бе-

рут заранее заготовленную пробирку с водной суспензией спор мицели-

ального гриба и наносят бактериологической петлей каплю суспензии на поверхность сусла-агара в центре пластинки. Засеянные чашки помещают вверх дном для выращивания культуры при соответствующих температу-

рах (5, 25 и 40°С).

Кислотность среды

Большинство микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых про-

дуктов, развивается в нейтральной (рН 7.0), слабощелочной (рН 7,2–7,3)

или в слабокислой (рН 6,8–6,9) среде. Для мицелиальных грибов и дрожжей благоприятной является слабокислая среда, для бактерий – нейтральная. Значительные отклонения концентрации водородных и гид-

роксильных ионов от видовых потребностей к реакции среды влияют на развитие микробов. Изменяя кислотность среды, можно подавлять или стимулировать рост и развитие микробов, изменять направленность био-

химических процессов, что имеет большое практическое значение. Так,

кислая среда оказывает неблагоприятное воздействие на гнилостные бак-

терии, поэтому некоторые виды пищевых продуктов хранят в маринован-

ном или квашеном виде.

54

Самостоятельная работа

1.Посев культуры дрожжей на солодовое сусло с различным значением рН.

2.Посев культуры бактерий на МПБ с различными значениями рН.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Посев дрожжей

Приготовляют ряд из четырех пробирок с одинаковым объемом сте-

рильного солодового сусла с рН 3, 5, 7, 9. В каждую пробирку вносят пи-

петкой одинаковое количество суспензии дрожжей. Пробирки ставят в термостат для выращивания при температуре 30° С.

Задача 2. Посев бактерий

Приготовляют ряд пробирок, содержащих стерильный МПБ со зна-

чениями рН 3, 5, 7, 9. В каждую пробирку, строго соблюдая правила сте-

рильности, вносят бактериологической петлей взвесь гнилостных бактерий

(сенной и картофельной палочек, протея и др.). Пробирки помещают в термостат для выращивания при 37 °С.

Осмотическое давление

При высокой концентрации растворенных в среде веществ и, следо-

вательно, высоком осмотическом давлении у большинства микроорганиз-

мов наступает плазмолиз клетки – протоплазма выделяет воду и уплотня-

ется; при этом затормаживаются процессы обмена веществ и клетка пере-

ходит в состояние анабиоза. Явление плазмолиза положено в основу кон-

сервирования некоторых пищевых продуктов поваренной солью и саха-

ром. Следует помнить, что некоторые виды микроорганизмов способны легко переносить высокие концентрации растворов, даже нуждаются в них. Такие микроорганизмы носят название осмофилов. Некоторые из них

55

являются возбудителями порчи пищевых продуктов, консервированных

солью и сахаром, а также возбудителями пищевых заболеваний микробной

природы.

Самостоятельная работа

1.Изучение явления плазмолиза в клетках дрожжей в концентрированном растворе NaCl.

2.Определение влияния концентрации поваренной соли на размножение бактерий.

3.Определение влияния концентрации глюкозы на развитие мицелиально-

го гриба.

4.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Плазмолиз в дрожжевых клетках

Пекарские дрожжи разводят в дистиллированной воде до незначи-

тельной мутности суспензии. Каплю суспензии помещают на предметное стекло и вносят в нее несколько кристалликов поваренной соли. Через не-

сколько минут проводят микроскопию при увеличении в 900 раз (объекти-

вом 60х). В плазмолизированных клетках протоплазма отделяется от обо-

лочки и сморщивается. Микроскопическую картину следует зарисовать.

Задача 2. Влияние концентрации поваренной соли на бактерии

В три пробирки с МПБ, содержащим NaCl различной концентрации

(0, 5, 10 и 20 %) производят посев бактерий. Пробирки помещают в термо-

стат при температуре 37 °С.

56

Задача 3. Влияние концентрации глюкозы на мицелиальные грибы

Производят посев мицелиального гриба в пивное сусло с 20, 40 и 60%-ной концентрацией глюкозы и без нее (контрольный посев). Посевы помещают в термостат при температуре 25–35°С.

Антисептики

Химические вещества, губительно действующие на микроорганиз-

мы, называются антисептиками. Действие антисептиков на микроорганиз-

мы зависит от химической структуры вещества, его концентрации, про-

должительности контакта с клеткой (экспозиции), а также от чувствитель-

ности микроорганизмов к данному веществу. В значительной степени ак-

тивность антисептиков определяется и составом среды, в которой находят-

ся микроорганизмы.

Большинство антисептиков относится к группе общепротоплазмати-

ческих ядов, т. е. ядов, действующих не только на микробов, но и на лю-

бую животную и растительную клетку. Поэтому их применение для кон-

сервирования пищевых продуктов крайне ограничено, а вещества, которые разрешается использовать в качестве консервирующих, используются в малых дозах (от тысячных до десятых долей процента) и только для неко-

торых видов продуктов.

Многие антисептики используют для дезинфекции (обеззаражива-

ния) туалетов, складских помещений, холодильных камер, питьевой воды,

оборудования, инвентаря, дезинфекции рук и др. В качестве дезинфици-

рующего вещества широко применяют 0,5–5%-ные растворы фенола, 0,1– 10%-ные растворы хлорной извести.

Самостоятельная работа

1.Посев культуры мицелиальных грибов на среду, содержащую сорбино-

вую кислоту различной концентрации.

57

2.Посев споровых бактерий после обработки фенолом.

3.Посев бесспоровых бактерий после обработки фенолом.

4.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Влияние сорбиновой кислоты на мицелиальные грибы

(или дрожжи)

Бактериологической петлей производят посев спор мицелиальных грибов (или дрожжей) в стерильное солодовое сусло с сорбиновой кисло-

той 0,01; 0,1 и 0,5%-ной концентрации и без нее. Пробирки помещают в термостат при температуре 25 °С.

Задача 2. Влияние фенола на бесспоровые бактерии

Работа выполняется на двух занятиях.

В стерильную чашку Петри наливают 0,5%-ный раствор фенола.

Стерильным пинцетом берут три заготовленных ранее бактериальных те-

ста с кишечной палочкой и помещают их в раствор фенола. Через 5 мин вынимают пинцетом один из тестов, дважды (по 5 мин) промывают его в чашке Петри со стерильной водой и погружают в пробирку с МПБ. Через

15 мин, а затем через 30 мин проделывают то же самое с остальными те-

стами. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С для выра-

щивания в течение недели, поскольку фенол может угнетать жизнедея-

тельность бактерий.

Задача 3. Влияние фенола на споровые бактерии

Работа выполняется на двух занятиях по плану предыдущей работы,

но с бактериальным тестом, содержащим споровые бактерии (сенную па-

лочку и др.).

58

Антибиотики и фитонциды

Многие микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабаты-

вают биологически активные вещества, которые губительны для микро-

бов-антагонистов. Эти вещества получили название антибиотиков. От дру-

гих антимикробных веществ они отличаются избирательностью действия,

т. е. подавляют жизнедеятельность и уничтожают определенные антагони-

стические виды микроорганизмов.

Антибиотики различны по химической природе и антимикробному действию. Одни из них лишь угнетают развитие микроорганизмов, другие убивают их. Известны также антибиотические вещества, вырабатываемые высшими растениями (фитонциды) и животными организмами.

Самостоятельная работа

1.Посев бактериальной культуры на МПА в чашки Петри с дисками, про-

питанными антибиотиками.

2.Посев культуры мицелиальных грибов на сусло-агар с суспензией лука.

3.Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задача 1. Антибактериальное действие антибиотиков

Чашку Петри с застывшим МПА перевертывают вверх дном и пишут на нем номер группы и рабочего места. Затем кладут чашку на стол крыш-

кой вверх. Соблюдая правила стерильности, наносят пипеткой на поверх-

ность пластинки агара каплю взвеси бактерий (микрококки, сарцины или другие виды сапрофитов) и тщательно растирают ее по всей поверхности среды при помощи стерильного шпателя. Обожженным пинцетом наносят на поверхность агара диски, пропитанные антибиотиком (пенициллином,

стрептомицином, левомицетином, биомицином или др.). Диски распола-

59

гают по окружности чашки так, как показано на рис. 6. Чашки переверты-

вают вверх дном и помещают в термостат при температуре 37 С.

Рис. 6. Определение антибиотической активности

Задача 2. Антимикробное действие фитонцидов

В фарфоровую чашку натирают на терке луковицу, предварительно обли-

тую кипятком. Для опыта необходимы две чашки Петри с застывшим сус-

лом-агаром. Чашки надписывают со стороны дна, кладут на стол крышка-

ми вверх и пипеткой наносят в центр пластинки агара по 0,2 мл суспензии спор мицелиального гриба. Суспензию растирают с помощью шпателя равномерно по всей поверхности агара. Одна чашка является контрольной.

Во вторую чашку помещают в центр пластинки обожженным скальпелем кашицу лука (около 1 г). Обе чашки ставят в термостат при 25 С.

60