др.) и различных вкусовых наполнителей. В качестве сырья может использоваться не только коровье, но и козье, буйволиное и овечье молоко, а также их смеси.

9.2 Биотехнология в производстве алкогольных напитков

Получение напитков путем спиртового брожения – одно из древнейших бродильных производств. Первыми из таких напитков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастера в конце XIX в. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известно очень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляется живыми клетками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и углекислый газ. Тогда же было показано, что брожение осуществляется под действием каких-то веществ, находящихся внутри дрожжевых клеток.

Алкогольные напитки получают путем сбраживания сахар-содержащего сырья, в результате которого образуются спирт и углекислый газ. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces. В одних случаях используется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которого делают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработке зерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно для спиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжей не могут гидролизовать полисахариды. В производстве спиртных напитков при-

меняют штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae или S. carlsbergensis. Разли-

чие между ними заключается в том, что S. carlsbergensis могут полностью сбраживать раффинозу, a S. cerevisiae к этому не способны.

Пивоварение

Одно из главных нововведений в области микробиологии брожения было предложено Хансеном, работавшим в исследовательском центре Карлсберг в Копенгагене с дрожжами дикого типа. При производстве пива эти дрожжи доставляли массу неудобств. Хансен выделил чистые культуры дрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал пионером применения таких культур при производстве пива.

Для осуществления спиртового брожения при пивоварении, прежде всего, необходимо, чтобы в пивоваренном сырье образовался сахар. Традиционным источником нужных для этого полисахаридов всегда был ячмень, но в качестве дополнительных используются и другие виды углеводсодержащего сырья. И сегодня ячменный солод составляет основу пива.

Ячменный солод и другие компоненты измельчают и смешивают с водой при температуре до 67 °С. В ходе перемешивания природные ферменты ячменного солода разрушают углеводы зерна. На заключительной стадии раствор, называемый суслом, отделяют от нерастворимых остатков. Добавив хмель, его кипятят в медных котлах. Для производства пива с определенным содержанием алкоголя сусло после кипячения доводят до нужной плотности. Удельная плотность сусла определяется содержанием экстрагированных сахаров, подлежащих

58

сбраживанию. По истечении определенного времени брожение заканчивается, дрожжи отделяют от пива и выдерживают его некоторое время для созревания. После фильтрации и других необходимых процедур пиво готово.

Начатое по инициативе Хансена использование индивидуальных штаммов дрожжей в пивоварении сегодня стало нормой: это культуры S. cerevisiae и S. carlsbergensis. Первые представляют собой дрожжи поверхностного и глубинного брожения: они применяются в производстве эля. Вторые – дрожжи глубинного брожения, их используют в производстве легкого пива. Хотя генетика дрожжей развивается уже в течение многих лет, мы лишь недавно научились осуществлять селекцию дрожжей, используемых в производстве пива. По мере углубления наших знаний о свойствах дрожжей и тех качествах, которые они придают конечному продукту, все успешнее идет работа по выведению новых штаммов пивных дрожжей. В конечном счете, мы сможем создать штамм, позволяющий получить идеальный пивной продукт. Требования к таким идеальным дрожжам будут, естественно, зависеть от способа сбраживания и желаемых качеств пива.

К числу наиболее важных свойств дрожжей относятся продуктивность, способность формировать осадок, сбраживать мальтотриозу и т. д. Принимаются во внимание и вкусовые качества получающегося пива, т. е. образование веществ, ответственных за их формирование. Ранее основным способом получения штаммов, дающих продукт нужного качества, был их отбор из существующих пивных дрожжей. Вести отбор было выгоднее, чем заниматься гибридизацией, отчасти из-за малой способности пивных дрожжей к спорообразованию и низкой жизнеспособности аскоспор. В каждом аске образуется от одной до четырех спор, но не все они освобождаются при созревании. Дрожжи из рода Sacharomyces размножаются в основном вегетативно. При этом за счет множественного латерального почкования формируются сферические, эллипсоидные или реже цилиндрические дочерние клетки.

Поскольку для развития технологии пивоварения могут понадобиться штаммы дрожжей, отличающиеся по свойствам от обычно используемых, придется прибегнуть к гибридизации. Основным вкладом биотехнологии в пивоваренную промышленность будет создание штаммов дрожжей, способных давать пиво с желаемыми свойствами.

Виноделие

Необходимое условие любого спиртового бродильного процесса - наличие сахара в сырье. Так, в производстве вина используется сахар виноградного сока. Почти все вино в мире д елают из винограда одного вида – Vitis vinifera. Сок этого винограда - прекрасное сырье для производства вина. Он богат питательными веществами, служит источником образования приятных запаха и вкуса, содержит много сахара; его природная кислотность подавляет рост нежелательных микроорганизмов.

Виноделие, в отличие от пивоварения, до самого последнего времени было основано на использовании диких местных дрожжей. Единственная обра-

59

ботка, которой подвергали виноград до отжима, – окуривание его сернистым газом, чтобы сок не темнел. Кроме того, сернистый газ подавляет деятельность невинных дрожжей; это позволяет винным дрожжам, которые менее чувствительны к нему, осуществлять брожение без помех.

При изготовлении красного вина гребни, косточки и кожица до конца брожения находятся в виноградном сусле (мусте), а белое вино делают из чистого сока. Обычно окуривание сернистым газом проводят до того, как раздавливают ягоды, но иногда его добавляют и на более поздних стадиях. Количество используемого сернистого газа ограничено законом, и это побуждает применять дрожжевые культуры-закваски. Виноделы не очень-то полагаются на дрожжи дикого типа, если нет уверенности, что конкуренция со стороны невинных дрожжей не подавлена. Использование заквасок дает ряд преимуществ: сокращается лаг-период размножения дрожжей, образуется продукт с известными свойствами, уменьшается вероятность появления нежелательного вкуса, поскольку в брожении не участвуют дикие невинные дрожжи.

В будущем использование специально созданных штаммов будет все более расширяться: это гарантирует необходимые вкусовые качества вин. Смешанные закваски позволяют получать продукцию с полным букетом, что невозможно при работе с индивидуальными штаммами. Вкусовые различия между сортами винограда определяются особыми веществами. Так, в формировании вкуса мускатных сортов участвуют производные терпенов, линалоол и гераниол. Различные вкусовые оттенки появляются при выдержке вина, при взаимодействии с древесиной и воздухом во время хранения в деревянных бочках. Первосортные вина подвергают выдержке разного рода в зависимости от типа вина, а более дешевые разливают, как правило, в тот же год, когда они получены.

Трудности при выработке дешевых вин обычно связаны с их склонностью к вторичному, яблочно-молочно-кислому брожению, которое развивается ко времени разлива. Если вино склонно к такому брожению, его искусственно вызывают до разлива, а если нет, то подавляют. При производстве первосортных красных вин такое брожение даже желательно. Оно составляет естественную часть процесса и происходит при хранении. Этот тип брожения осуществляется молочно-кислыми бактериями, в частности Leuconostoc, Lactobacillus и Pedicoccus. Оно не идет при низких значениях рН; создав такие условия, его можно подавить. В белых винах яблочно-молочно-кислое брожение происходит реже, так как рН в них ниже.

Среди новшеств в этой области упомянем использование для инициации брожения вместо бактерий иммобилизованных ферментов. Некоторые особые сорта вин, например, сотерны, получают при участии гриба Botrytis cinerea. Его развитие на ягодах приводит к их обезвоживанию и повышению содержания сахара, что и определяет сладкий вкус вина. Заражение должно происходить только перед сбором винограда.

Представляет интерес и еще один процесс, называемый углекислотной мацерацией. Красные вина, которые должны созреть к 15 ноября в год сбора винограда, получают особым способом. Виноград не давят, а помещают цели-

60

ком в бродильные чаны, где держат в атмосфере углекислого газа. Брожение идет либо прямо в ягодах, в анаэробных условиях, либо в соке, выделяющемся в результате разрушения кожицы углекислым газом. Микробиология этого процесса пока не исследована.

В крепленых винах часть спирта получается при сбраживании винограда дрожжами, а часть добавляется. К числу таких вин относятся портвейн, херес и мадера.

Производство спиртов и полиолов

Этиловый спирт используется для технических нужд – для производства синтетического каучука, как растворитель, для синтеза других веществ, а также на изготовление напитков и медицинские нужды. Спиртовое брожение – хорошо изученный биохимический процесс. Спиртовое брожение вызывают чаще всего дрожжи, реже некоторые бактерии (Sarcina) и плесневые грибы (Mucor). В промышленности дрожжи обычно разделяют на верховые и низовые. Верховые дрожжи интенсивно ведут брожение и труднее осаждаются. К ним принадлежат спиртовые и хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, а также винные дрожжи из вида Saccharomyces elipsoideus. К низовым дрожжам относятся виды, используемые в пивоваренной промышленности. В производстве процесс брожения ведут двое-трое суток.

Входе брожения углеводы распадаются в конечном итоге до этилового спирта, углекислого газа и воды. Промежуточный продукт – ацетальдегид. Если

кпитательной среде добавить сульфиты, которые связывают ацетальдегид, при брожении можно получить значительное количество глицерина, что и применяется в промышленности. В этом случае основной конечный продукт брожения – трехатомный спирт глицерин. В процессе спиртового брожения могут накапливаться изоамиловый, амиловый и изобутиловый спирты (сивушные масла). Некоторые дрожжи и бактерии способны продуцировать бутанол, а также 2,3-бутандиол. Эти продукты обычно синтезируют из нефти, однако микробное получение этанола и других спиртов вызывает все больший интерес.

ВРоссии большая часть этанола получается микробиологическим путем из растительного сырья. Сырьем могут быть гидролизаты древесины, меласса, крахмал, молочная сыворотка. Отходы производства этанола содержат белки, углеводы, рибофлавин и другие витамины, и могут использоваться как кормовая добавка.

При получении спирта из древесины перед гидролизом древесину раз-

мельчают до стружек толщиной 3, шириной 10-70 и длиной 25 мм. Гидролиз идет в больших (до 50 м3) гидролизных аппаратах, которые наполняют струж-

кой, добавляют 0,5%-ный раствор Н2SО4 и вводят пар давлением 1-1,2 МПа. Варка идет 40-50 мин. Выход сахара 45-48% от сухой массы древесины. Реакция среды полученного гидролизата кислая, рН 1,8-2,2, поэтому гидролизат нейтрализуют известковым молоком, в котором содержится 1,1-1,2 кг/л извести; в гидролизате сравнительно мало азота и фосфора, поэтому предварительно к каждому кубическому метру гидролизата добавляют 0,3 кг суперфосфата и

61

0,15 кг сульфата аммония. При температуре 85°С через гидролизат продувают воздух, рН среды 5-6. Гипс осаждают, а прозрачную часть гидролизата после охлаждения используют для сбраживания. Спирт получают и из мелассы. Предварительная подготовка питательной среды очень проста – мелассу разбавляют и добавляют питательные соли.

Для приготовления напитков используют спирт, полученный только из пищевого сырья. Для технических нужд используют спирт, полученный из гидролизатов древесины, сульфитного щелока.

В настоящее время наблюдается сдвиг в сторону получения микробиологического этанола. Найдены бактерии Zymomonas mobilis, которые вдвое эффективнее сбраживают углеводы в этанол, чем дрожжи.

Интенсивно развивается производство биоэтанола (топливного спирта), который отличается от пищевого или технического этанола характеристиками примесей и добавлением специальных веществ, называемых присадками. Лидерами по производству биоэтанола являются Латиноамериканские страны. Например, в Бразилии производство топливного спирта вносит наибольший вклад в энергобаланс страны и составляет миллиарды литров. Биотопливная промышленность уже вырабатывает биопропанол, биобутанол и другие кислородосодержащие спирты, используемые в качестве добавок к традиционному горючему или самостоятельно.

Ферментация мелассы различными видами Clostridium acetobutilicum, другими бактериями, вызывающими масляно-кислое брожение, может быть использована для получения не только этанола, но и ацетальдегида, уксусной кислоты, этилацетата и диэтилового эфира. Субстратом для такого брожения могут быть зерновые, мелассно-зерновые заторы или меласса. Если среду готовят из зерна, например, кукурузы, то сначала получают муку грубого помола, ее смешивают с водой из расчета 6-8 кг муки на 100 л воды. Затем затор варят 2 ч под давлением 0,2 МПа и стерилизуют. Охлажденную до 37-42°С массу сбраживают в течение двух суток, рН среды 5-7. В процессе брожения из глюкозы образуется смесь, содержащая шесть частей бутилового спирта, одну часть этилового спирта и три части ацетона. Разработаны методы получения ацетона и бутилового спирта из сульфитного щелока и гидролизатов древесины. В ацето- но-бутиловом брожении в первый период образуется уксусная и масляная кислоты, выделяется водород и углекислый газ. Затем масляная кислота восстанавливается до бутилового спирта.

Штаммы-продуценты первичных метаболитов получают путем индуцированного мутагенеза, так как в природе мутации, ведущие к сверхпродукции одного из метаболитов вредны. Нарушения в обмене веществ приводят к снижению конкурентоспособности и жизнеспособности микроорганизмов. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей. Мутантные формы микроорганизмов могут синтезировать аминокислоты вплоть до концентрации 100 г/л (для сравнения – организмы дикого типа накапливают аминокислоты в количествах, исчисляемых миллиграммами).

62

Вопросы для самопроверки:

1)Охарактеризуйте химический состав молока и основные направления его переработки.

2)Опишите процессы первичной и вторичной переработки молока?

3)Какие виды молочно-кислого брожения вы знаете, где они используются?

4)Назовите основные этапы производства сыров.

5)Какие микроорганизмы используют для производства алкогольных напитков?

6)Что является сырьем для производства белых и красных вин?

7)Какое сырье используется в спиртовом производстве и что такое спиртовое брожение?

63