14 БИОТЕХНОЛОГИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т. д.

Ферменты – вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 г., когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин «иммобилизованные ферменты» узаконен в 1971 г. и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Сущность иммобилизации ферментов – прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании ферментсубстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно, чтобы была большая поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1-0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.

Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1.Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2.Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3.Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4.Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмоле-

98

кулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения.

Вопросы для самопроверки:

1)Что такое ферменты? Где они используются?

2)В чем сущность процесса иммобилизации ферментов?

3)Какие вещества используются для иммобилизации ферментов?

4)Назовите преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными.

5)Что такое гомогенный и гетерогенный катализ?

6)Что такое активность ферментов?

7)Как регулируется активность ферментов?

99

Эти микроорганизмы удобно использовать для очистки нефтяных пятен на суше или море при различных авариях. Для большей эффективности создают микроэмульсию, содержащую бактериальные штаммы и капсулы со смесью основных питательных элементов – азота, фосфора и калия внутри. Добавление этих веществ стимулирует размножение бактриальных штаммов. Применение такого метода позволяет очистить от 70 до 90% загрязненной поверхности, за это же время очищается всего порядка 10-20% необработанной поверхности.

Преимущество бактериальной очистки по сравнению с химической в том, что она не вызывает появления нового загрязняющего агента в окружающей среде. Плотность фитопланктона после бактериальной очистки повышается. Некоторые микроорганизмы способны изменять молекулу ксенобиотика и делать ее доступной и привлекательной для других микроорганизмов («кометаболизм»). Примером может служить разложение инсектицида паратиона под дей-

ствием двух штаммов Pseudomonas – P. aeruginosa и P. stuzeri. В некоторых слу-

чаях происходит неполное превращение молекулы ксенобиотика – фосфорилирование, метилирование, ацетилирование и т. д., результатом которого является утрата этим веществом токсичности.

Одним из сильных загрязнителей является ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Причина в том, что ЭДТА связывает тяжелые металлы, способствуя их накоплению в почве. Бактрии родов Pseudomonas и Bacillus способны за две недели разрушить все связи комплекса Fe-ЭДТА. Они успешно применяются для очистки бытовых сточных вод, куда попадают детергенты моющих средств. Кроме Pseudomonas, биодеградацию ксенобиотиков могут осуществлять и представители родов Acinetobacter, Metviosinus.

Однако в некоторых случаях внесение этих микроорганизмов в почву может изменить экосистему местности. Избежать этого можно ограничивая время жизнедеятельности бактерий. Например, облучая штаммы ультрафиолетом, получили мутант, ауксотрофный по лейцину. Бактерии размножают в питательной среде, содержащей лейцин. Суспензией микроорганизмов в питательной среде пропитывают древесную стружку, которую разбрасывают по загрязненной территории. Количество лейцина рассчитывается на время, достаточное для уничтожения вредных примесей, поэтому после очистки мутантные штаммы гибнут.

Еще эффективнее, чем бактерии, справляются с почвенными загрязнителями грибы. Они могут разрушать такие вещества, как пентахлорбензол, пентахлофенол. В одном из экспериментов грибами обработали около 10000 т почвы с территории деревоперерабатывающего комплекса. Содержание пентахлорфенола в этой почве достигало 700 мг/кг, но за год деятельности оно снизилось до 10 мг/кг, что является допустимой нормой. Бактерии смогли бы переработать эту почву лишь за 4-5 лет. Грибы активны и зимой, разрушают высокомолекулярные полиароматические углеводороды, действуют внеклеточно, выделяя неспецифические ферменты. Стоимость грибной и бактериальной очистки одинакова, но применение грибов позволяет сокращать сроки деградации, что ведет к её существенному удешевлению.

101

Биотехнология обработки стоков и контроль загрязнения воды тяжелыми металлами – важная функция биотехнологии в решении экологических проблем.

Развитие промышленности ведет к образованию большого количества отходов, в том числе отходов, содержащих новые антропогенные компоненты. Методами биотехнологии эти отходы могут быть переработаны в полезные или безвредные продукты.

Бытовые отходы делятся на две группы: твердые отходы и сточные воды. Твердые бытовые отходы состоят из целлюлозосодержащих материалов (до 40 % бумаги, 2,5 – дерева, 8 – текстиля) и пищевых отходов (40%). Наибо-

лее экономична и радикальна переработка их метановым брожением. В результате образуется легко транспортируемое топливо – метан.

Сточные воды обычно содержат сложную смесь нерастворимых и растворимых компонентов различной природы и концентрации. Бытовые отходы, как правило, содержат почвенную и кишечную микрофлору, включая патогенные микроорганизмы.

Сточные воды сахарных, крахмальных, пивных и дрожжевых заводов, мясокомбинатов содержат в больших количествах углеводы, белки и жиры, являющиеся источниками питательных веществ и энергии.

Стоки химических и металлургических производств могут содержать значительное количество токсических и даже взрывчатых веществ. Серьезное загрязнение возникает при попадании в окружающую среду соединений тяжелых металлов, таких как железо, медь, олово и др.

Цель очистки сточных вод – удаление растворимых и нерастворимых компонентов, элиминирование патогенных микроорганизмов и проведение детоксикации таким образом, чтобы компоненты стоков не вредили человеку, не загрязняли водоемы.

Бактерии рода Pseudomonas практически всеядны. Например, P. putida могут утилизировать нафталин, толуол, алканы, камфару и другие соединения. Выделены чистые культуры микроорганизмов, способные разлагать специфические фенольные соединения, компоненты нефти в загрязненных водах и т. д. Микроорганизмы рода Pseudomonas могут утилизировать и необычные химические соединения – инсектициды, гербициды и другие ксенобиотики. Генетически сконструированные штаммы микроорганизмов в будущем смогут решить проблему очистки сточных вод и почв, загрязненных пестицидами и другими антропогенными веществами. Пестициды поступают в окружающую среду после обработки сельскохозяйственных культур. Большинство из них расщепляются бактериями и грибами. Лучше всего биодеградация пестицидов удается, если микроорганизмы действуют сообща, в химических реакциях сопряженного метаболизма. При этом уже на первой стадии микробной трансформации токсичность большинства пестицидов утрачивается, что позволяет разрабатывать относительно простые биотехнологические методы борьбы с ними. Первичный гидролиз пестицидов можно проводить и с помощью ферментов, таких

102

как гидролазы, эстеразы, фосфоэстеразы, ациламидазы. Пестициды из сточных вод можно удалять, используя иммобилизованные формы этих ферментов.

Биологические методы также применимы для очистки сточных вод нефтяной промышленности. Для этого применяют аэрируемые системы биоочистки с активным илом, содержащим адаптированное к компонентам нефти микробное сообщество. Скорость деградации зависит от качественного состава и концентрации углеводородов, а также температуры и степени аэрации среды. Наиболее эффективно биодеградация осуществляется, когда нефть эмульгирована в воде.

В институте прикладной биохимии и машиностроения разработан отечественный препарат – биодеградант нефти и нефтепродуктов. Он позволяет утилизировать как сырую нефть, так и различные нефтепродукты: мазут, дизельное топливо, бензин, керосин, ароматические углеводороды. Микроорганизмы сообщества способны эффективно окислять широкий спектр углеводородов нефти, в том числе и ароматические углеводороды, в широком диапазоне температур (8-35°С) и кислотности среды (рН 3.5-10.0) с оптимумом 6.5-7.5. Биопрепарат работает при высоком уровне загрязнения до 20%, с высоким содержанием тяжёлых углеводородов.

Преимуществом данного препарата является то, что в сухой форме его получают по новой технологии распылительной сушки, что обеспечивает его низкую себестоимость при сохранении высокой активности (концентрация клеток в препарате 1010 кл/г). Производство и применение биопрепарата выгодно отличается сравнительно низкими себестоимостью и энергозатратами, легкой транспортировкой, отсутствием вторичных отходов, экологической безопасностью, связанной со способностью разлагать углеводороды нефти на экологически нейтральные соединения.

Азотсодержащие соединения (белки, аминокислоты, мочевина) могут быть удалены в биологическом процессе денитрификации-нитрификации. Биологическое удаление азота и фосфора, являющихся причинами эвтрофикации (зарастания озер микроводорослями, которые бурно размножаются, затем отмирают, давая пищу аэробным бактериям, потребляющим кислород, что приводит к замору рыбы) озер и каналов, находится в стадии экспериментов.

Тяжелые металлы затрудняют биологические процессы очистки стоков и отрицательно влияют на флору и фауну. Природные штаммы микроорганизмов не могут быть использованы для накопления этих металлов в силу их высокой токсичности. Однако есть белок высших организмов – металлотионеин, который активно связывает различные тяжелые металлы. Ген, кодирующий синтез мышиного металлотионеина, клонирован в бактериях. Это открывает возможность получения белка в больших количествах с использование иммобилизованных бактерий и его использования для связывания и экстракции тяжелых металлов.

103

Вопросы для самопроверки:

1)Что такое ксенобиотики? Приведите примеры.

2)Какие факторы определяют удаление ксенобиотиков из окружающей среды?

3)Как происходит биодеградация ксенобиотиков? Какие микроорганизмы осуществляют биодеградацию?

4)Какие преимущества имеет бактериальная очистка перед химической?

5)Назовите пути переработки твердых отходов.

6)Назовите пути очистки сточных вод.

7)Как удаляют тяжелые металлы из сырья или продуктов питания?

104