Биохимия крови. Лабораторный практикум

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Е.С. Барышева, К.М. Бурова

БИОХИМИЯ КРОВИ

Лабораторный практикум

Рекомендовано Ученым советом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет» в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по программам высшего профессионального образования по направлению подготовки 020400 Биология

Оренбург

2013

УДК 577.1 (076.5)

ББК 28.072 я7 Б 26

Рецензент – кандидат химических наук Е.В.Сальникова

Барышева, Е.С.

Б 26 Биохимия крови: лабораторный практикум / Е.С. Барышева, К.М.Бурова; Оренбургский гос. ун-т. – Оренбург: ОГУ,2013. – 141с.

Лабораторный практикум по биохимии крови отличается доступным изложением и описанием основных показателей крови, методов их определения, установлены взаимосвязи между значениями показателей анализа крови и состоянием целого организма. Цель учебного пособия – формирование у студентов навыков определения биохимических показателей крови и изучение основ в области клинической биохимии.

Лабораторный практикум предназначен для студентов, обучающихся по программе очной формы обучения по направлению подготовки 020400 «Биология» профиля «Биохимия» при изучении дисциплины «Биохимия крови» в 5 семестре и для магистров магистерской программы «Биохимия и молекулярная биология» при прохождении дисциплин «Клиническая биохимия» и «Биохимия патологических процессов» в 4 семестре.

УДК 577.1 (076.5)

ББК 28.072 я7

© Барышева Е.С.,

Бурова К.М., 2013

© ОГУ, 2013

2

Содержание

2.1Техника взятия крови……………………………………………………….. 86

2.2Центрифугирование крови…………………………………………………. 93

2.3 Электрофорез белков сыворотки крови…………………………………… 95

2.4Хроматография для разделения аминокислот в плазме крови…………... 100

2.5Методы определения общего белка в сыворотки крови………………….. 105

2.6Методы определения глюкозы в сыворотке крови……………………….. 110

Список использованных источников…………………………………………... 118

Приложение А СанПиН 2.1.3.2630-10 Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность..……………………………………………………………………. 120

Приложение Б СанПиН 2.1.7.2790-10 Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами ……………………….. 128

3

Приложение В Вопросы к практическим занятиям по дисциплине

«Биохимия крови»…………………………………………………………......... 136

Приложение Г Экзаменационные вопросы по дисциплине «Биохимия крови» для студентов направления подготовки 020400.62 Биология профиль подготовки «Биохимия»……………………………………………… 139

4

Введение

Кровь отличается от других тканей своим агрегатным состоянием – она жидкая. Такое свойство связано с ее функцией – транспортной. Выделяют две фазы крови: жидкую (плазма) и плотную (клетки крови).

Биохимический анализ крови – это обследование, которое производится лабораторным методом. Он позволяет дать оценку обмена веществ и работе внутренних органов.

Цели освоения дисциплины: формирование у студентов системы знаний,

умений и навыков по вопросам основных функций и физико-химических свойств крови, а также методам оценки функции крови.

Задачами дисциплины является:

1.Изучение состава крови, системы гемостаза, группы крови,

специфические механизмы защиты (специфический иммунитет), лабораторные показатели системы крови.

2. Формирование основополагающего уровня знаний, необходимых для подготовки специалиста на современном уровне, способного правильно анализировать общебиологические закономерности и законы биохимии применительно к изучаемой дисциплине.

Дисциплина относится к дисциплинам по выбору профессионального цикла.

Изучение данной дисциплины базируется на дисциплинах: биохимия,

молекулярная биология.

Основные положения дисциплины должны быть использованы в дальнейшем при изучении следующих дисциплин: методы биохимических исследований, спектральные методы исследования в биохимии,

иммунохимические методы исследования, клиническая биохимия и биохимия патологических процессов.

5

1 Лабораторные работы

1.1 Лабораторная работа № 1. Техника получения сыворотки крови

Кровь представляет собой непрозрачную жидкость красного цвета со слабощелочной реакцией (pH 7,3 – 7,5) плотностью 1,050-1,060, своеобразным запахом и солоноватым вкусом. Постоянно циркулируя в артериях, венах и капиллярах тела, кровь разносит в органы и ткани кислород, питательные вещества и освобождает их от углекислоты и конечных продуктов распада. Она выполняет также важную функцию защиты организма от инфекций и токсинов, а

также обладает способностью свертываться при ранении.

Кровь состоит из плазмы (от 50 % до 55 %) и форменных элементов:

эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (от 45 % до 50 %). В состав крови входят белки, жиры, углеводы, различные промежуточные и конечные продукты обмена, гормоны, витамины и минеральные соли. Несмотря на непрерывное поступление в кровь и выделение из нее различных веществ, в норме морфологический и химический состав крови довольно постоянен. В здоровом организме все случайные колебания в составе крови быстро выравниваются.

Однако всякие нарушения характера метаболических процессов в тканях отражаются на составе крови, поэтому определение количественного содержания ряда составных частей крови имеет исключительно важное значение для оценки здоровья организма.

Для получения сыворотки кровь ставят в термостат при температуре 37 °С.

Через 1 ч ее переносят на холод. Для лучшего отделения сгустка крови от сыворотки необходимо обвести сгусток по краям пробирки стеклянной или деревянной палочкой. Через 4-5 ч стояния на холоде сыворотка в виде прозрачной жидкости отделяется от кровяного сгустка и может быть использована для исследования. Отстоявшуюся сыворотку осторожно сливают,

придерживая сгусток, или отсасывают шариковой пипеткой в чистую пробирку.

6

Для быстрого получения сыворотки свернувшуюся кровь центрифугируют при 2500-3000 об/мин. В этом случае кровь набирают сразу в центрифужную пробирку. Прозрачную сыворотку сливают в чистую пробирку и хранят на холоде при температуре от +3 °С до +7 °С.

Свертывание крови представляет собой очень сложный процесс, в котором важную роль играют ферментативные реакции. Детали этого процесса все еще остаются неясными. Схематически этот процесс сводится к следующему.

В плазме крови растворен белок фибриноген. Под действием фермента тромбина фибриноген превращается в нерастворимый фибрин. Фибрин, выпадая в виде нитей, захватывает форменные элементы крови и образует сгусток.

Фермент тромбин образуется в крови из недеятельного профермента – протромбина (тромбогена) под действием ионов кальция и тромбокиназы:

Тромбокиназа – липопротеид и содержится в клетках всех тканей,

особенно много ее в тромбоцитах. При повреждении ткани и тромбоцитов выделяется тромбокиназа и происходит свертывание крови. Образование протромбина в организме возможно лишь при участии витамина К.

Различные вещества (антикоагулянты), действующие на тот или иной этап описанного выше сложного процесса, нарушают свертывание крови. Так,

щавелевокислые и фтористые соли осаждают кальций, а лимоннокислые соли образуют с кальцием прочный комплекс. Под действием этих агентов концентрация ионов кальция в плазме крови снижается и свертывание становится невозможным. Гирудин (вещество, выделяемое слюнными железами пиявок) тормозит действие тромбина на фибриноген и тем нарушает последнюю фазу свертывания крови. Гепарин – гетерополисахарид, получаемый из печени,

препятствует взаимодействию ионов кальция и тромбогена, нарушая фазу образования активного тромбина.

7

1.2 Лабораторная работа № 2. Получение плазмы крови

Плазма крови является сложной биологической средой, в состав которой входят вода (от 90 % до 92 %) и важные для функций крови органические и неорганические вещества, различные белки (альбумина от 4 % до 5 %, глобулина от 2 % до 3 %, фибриногена от 0,2 % до 0,4 %), глюкоза (от 85 до 110 мг),

аминокислоты и минеральные вещества (0,95 %), среди которых находятся ионы

Nа+, К+, Са2+, Мg2+. В плазме содержатся гормоны, витамины, растворенные газы. Установлено также наличие в ней ферментов, участвующих в свертывании крови, в расщеплении пищевых веществ и окислительно-восстановительных процессах. Количество белков приближается к уровню взрослых к 3—4 годам. С

возрастом количество альбуминов уменьшается, а глобулинов увеличивается.

Гамма-глобулины доходят до нормы взрослых к трем годам, а альфа- и бета-

глобулины — к семи годам. К минеральным веществам относятся: поваренная соль от 0,85 % до 0,9 %, хлористый калий, хлористый кальций и бикарбонаты

0,02 % и др. У новорожденных количество натрия меньше, чем у взрослых и доходит до их нормы у младших школьников. С 6 до 18 лет содержание натрия колеблется от 170 до 220 мг. Количество калия, наоборот, самое высокое у новорожденных, самое низкое у дошкольников и доходят до нормы взрослых к

13—19 годам. У новорожденных содержание кальция в плазме выше, чем у взрослых. С 1 до 6 лет оно колеблется (его количество меньше или больше, чем у взрослых), а с 6 до 18 лет становится относительно постоянным на уровне взрослых. У мальчиков от 7 до 15 лет неорганического фосфора больше, чем у взрослых в 1,3 раза, а органического больше, чем неорганического в 1,5 раза, но меньше, чем у взрослых. Количество глюкозы в крови взрослого человека натощак от 0,1 % до 0,12 %. Кроме того, в плазме крови содержатся разные азотистые вещества, составляющие от 20 до 40 мг на 100 см3 крови, от 0,5 % до 1 % жира и жироподобных веществ.

8

1.2.1 Получение плазмы крови

Для получения плазмы кровь выпускают в коническую колбу в 10 %-ный раствор оксалата калия, натрия или аммония, взятый с таким расчетом, чтобы содержание оксалатной соли составляло 0,1 % к взятой крови. Если требуется кровь неразбавленная, то вместо раствора соли берут ее навеску в порошке.

Выпускаемая кровь осторожно взбалтывается в сосуде круговыми движениями,

чтобы быстрее смешать соль или раствор соли с кровью. Плазма может быть отделена от форменных элементов отстаиванием или центрифугированием (15-

20 мин при 2500-3000 об/мин), плазма отсасывается пипеткой (рисунок 1).

Рисунок 1 – Плазма, отделенная от форменных элементов

Щавелевокислые соли можно заменить фтористым натрием, добавляя его в количестве 0,3 %. Лимоннокислый натрий применяется в растворе или в порошке из расчета от 0,1 % до 0,2 %. Гепарин и гирудин применяются в виде порошка в количестве 1 мг на 5-10 мл крови. Оксалатная кровь не может самопроизвольно свертываться, и поэтому ее можно сохранять в холодильнике продолжительное время.

9

1.2.2 Получение дефибринированной крови

Собирают вытекающую из сосуда кровь в стакан и осторожно перемешивают ее деревянной или стеклянной палочкой, стараясь не касаться стенок стакана, чтобы не разрушить эритроциты и избежать гемолиз.

Через несколько минут начинает выделяться в виде волокон фибрин,

который наматывают на палочку. Кровь, из которой удален фибрин, называют дефибринированной: такая кровь уже не способна к свертыванию.

Дефибринирование крови можно произвести с помощью другого метода. В

стакан или колбу кладутся стеклянные шарики (бусы), на которые и собирают кровь, вытекающую из кровеносного сосуда. В процессе взятия крови содержимое стакана (колбы) помешивают круговыми движениями, при этом фибрин оседает на шариках. Жидкую кровь сливают через двойной слой марли и центрифугируют ранее описанным методом. Форменные элементы крови оседают на дно, а сыворотка отсасывается пипеткой.

1.2.3 Определение резервной щелочности крови

Концентрация водородных ионов в крови у человека равна 7,36. У

сельскохозяйственных животных она также поддерживается на относительно постоянном уровне (таблица 1).

10