Биохимия крови. Лабораторный практикум

2.1.3 Антикоагулянты

Антикоагулянты требуются в большинстве гематологических исследований. Не последнюю роль играет выбор антикоагулянта. Наиболее часто используют К2 ЭДТА или К3 ЭДТА (двуили трикалиевый этилендиаминтетрацетат или трилон Б), тринатрий-цитрат и гепарин. Первые два вещества ингибируют коагуляцию, связывая кальций крови; гепарин действует в качестве ко-фактора образования комплекса тромбина с антитромбином III

плазмы, в результате тромбин связывается и не переводит фибриноген в фибрин,

кровь не свертывается.

ЭДТА - предпочтительный антикоагулянт при подсчете форменных элементов крови с использованием автоматических гематологических анализаторов. Недостаток антикоагулянта приводит к микросвертыванию крови

иобразованию сгустка, избыток - является причиной роста осмотического давления крови и сморщивания клеток. Изменение концентрации антикоагулянта от измерения к измерению могут вызвать неконтролируемые отклонения исследуемых параметров крови связанных, прежде всего, с объемом эритроцитов

итромбоцитов. У некоторых пациентов может наблюдаться небольшая спонтанная агрегация тромбоцитов или реже, так называемая ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопепия (иммунного характера). Использование Na ЭДТА не рекомендуется вследствие его плохой растворимости в крови.

Гепарин - лучший антикоагулянт для определения осмотической резистентности эритроцитов и функциональных исследований лейкоцитов,

включая ряд тестов с иммунологическими маркерами. Особенностью действия этого антикоагулянта является способность максимально предотвращать гемолиз. Мазки, приготовленные из гепаринизированной крови и окрашенные по Романовскому, имеют голубоватый фон.

Цитрат натрия - антикоагулянт выбора при исследованиях свертывающей системы крови и функции тромбоцитов. Применение в качестве антикоагулянтов

91

гепарина или цитрата натрия сопровождается изменениями в структуре клеток и поэтому не рекомендуется для исследования морфологии клеток крови, кроме того, гепарин не предотвращает агрегацию клеток, поэтому его нецелесообразно использовать при подсчете лейкоцитов и тромбоцитов.

Несоответствие концентрации антикоагулянта объему взятой крови, а

также недостаточно тщательное смешивание может привести к значительным ошибкам, в том числе повлечь за собой неточное определение концентрации клеточных элементов, искажение морфологической структуры клеток.

2.1.4 Доставка, хранение и подготовка проб к исследованию

Исследование крови необходимо проводить либо непосредственно после взятия (исключается возможность спонтанной агрегации тромбоцитов), либо спустя 25 - 240 мин (время, необходимое для адаптации тромбоцитов к антикоагулянту).

Сразу после взятия и непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана вручную в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.

При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (от 4 °С до 8 °С) и исследуют в течение 24 часов. Кровь нельзя замораживать. При длительном хранении происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах. Однако при наличии патологических клеток,

92

последние могут изменяться или даже разрушаться вследствие апоптоза в течение нескольких часов с момента взятия крови.

Исследование крови на приборе проводится при комнатной температуре.

Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и

форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь,

приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной флагирования при трехчленной дифференцировке лейкоцитов вследствие сжатия лейкоцитарной гистограммы.

При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), нарушения температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые вакуумные пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры.

Для перевозки крови на большие расстояния часто применяют вакуумные пробирки с разделительным гелем.

2.2 Центрифугирование крови

Центрифугирование проводит разделение смесей, состоящих из двух или нескольких компонентов с разной удельной плотностью. Разделение частиц с помощью центрифугирования основано на разной скорости осаждения частиц в центробежном поле (рисунок 7).

В лабораторной практике чаще всего применяют препаративное центрифугирование, основанное на различиях в скорости седиментации частиц,

отличающихся друг от друга плотностью и размерами. Разделяемый материал (в

93

лабораториях это чаще всего кровь) по мере увеличения скорости центробежного ускорения распределяется по плотности и размерам частиц вдоль пробирки. На дно пробирки осаждаются форменные элементы крови, в

надосадке — плазма или сыворотка крови.

Для разделения крови в лабораториях используют центрифуги общего назначения. Они обеспечивают центрифугирование со скоростью до

8000 об/мин, относительное центробежное ускорение до 6000 g. Отличаются друг от друга емкостью, рядом сменных роторов. Во всех центрифугах данного типа роторы жестко крепятся на валу привода, центрифужные пробирки должны быть вместе с находящимся в них биоматериалом тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. При неполной загрузке ротора пробирки должны быть размещены симметрично, одна против другой. Таким образом обеспечивается равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Например, мини-центрифуга СМ-6 со скоростью вращения ротора 1000,

1500, 2750 об/мин рассчитана на 12 пробирок в роторе, применяется для разделения растворов на фракции. Данная центрифуга используется в клинической биохимии, биологии, аналитической химии и т.д.

Мини-центрифуга СМ-70 имеет счетчик определения гематокритного числа. Ее конический ротор рассчитан на 8 капилляров, помещаемых в съемные адаптеры. Система управления обеспечивает поддержание оборотов и автоматическое отключение через заданный интервал времени.

Рисунок 7 – Результат дифференциального центрифугирования

94

2.3 Электрофорез белков сыворотки крови

Электрофорез – базовый метод клинической биохимии, широко используется при исследовании и нарушений белкового спектра сыворотки крови, реже – мочи и спинномозговой жидкости.

Принципиальной основой данного метода является тот факт, что находящиеся в растворе и обладающие электрическим зарядом молекулы под действием сил электрического поля смещаются в сторону противоположно заряженного электрода. Скорость миграции различных белков зависит от их массы (размера) и их электрического заряда.

Со времени, когда метод был впервые описан (более 200 лет назад),

большие изменения претерпели носители, на которых осуществляется разделение: это были фильтровальная бумага, жидкостные буферные системы,

агароза, целлюлозные и ацетатцеллюлозные пластинки, полиакриламидный гель и др.

Электрофоретическое разделение протеинов предполагает уточнение диагностической информации, позволяет изучать биологические и физические характеристики белков, являясь индикатором заболеваний печени, почек,

иммунной системы, злокачественных патологий, острых и хронических инфекций, генетических поломок и многих других видов патологий.

Электрофорез как биохимический метод – мощное приспособление для оценки широкого спектра патологий, выявления тех или иных нарушений деятельности различных органов и систем организма, имеет большое значение в наблюдении за динамикой патологического процесса, оценке эффективности проводимого лечения.

Используя метод электрофореза на гелевых носителях, можно разделить сывороточные белки на 5 основных фракций:

1) альбумины (от 55,8 % до 65 %): повышение уровня альбуминов свидетельствует о нарушении водно-солевого баланса организма; снижение

95

характерно для острого воспалительного процесса, заболеваний печени,

нефротического синдрома, злокачественных новообразований, регистрируется при ожогах и др. Это достаточно гетерогенная фракция по содержанию белков различной молекулярной массы;

2) α1-глобулины (от 2,2 % до 4,6 %) – белки острой фазы воспаления: С-

реактивный белок, α1-антитрипсин, α1-кислый гликопротеид и др. Увеличение содержания белков этой фракции характерно для острого воспалительного процесса, системных ревматических заболеваний, злокачественных опухолей,

некроза тканей, различного рода травм (рисунок 8). Снижение их содержания наблюдается при заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением синтеза белка, при массовой кровопотере, нарушении питания и др.;

Рисунок 8 – Электрофореграмма при остром воспалении

3) α2-глобулины (от 8,2 % до 12,5 %) – в основном углеводсодержащие белки (гликопротеиды). Их уровень увеличивается при остром воспалительном процессе и остается высоким при хронических воспалениях (рисунок 9),

96

нефротическом синдроме, злокачественных новообразованиях, инфаркте миокарда, остром полиартрите, обтурационной желтухе и др.;

Рисунок 9 – Электрофореграмма при хроническом воспалении

4) β-глобулиновая фракция (от 7,2 % до 14,2 %): повышение содержания белков этой группы характерно для гиперлипопротеидемий, застойной желтухи,

гепатита различной этиологии, нефротического синдрома (рисунок 11), цирроза печени и др.;

5) γ-глобулины (иммуноглобулины, от 11,5 % до 18,6 %): увеличение их содержания связано с интенсификацией иммунологических процессов при различных патологиях, хроническом воспалении, аутоиммунных заболеваниях,

туберкулезе легких, пиелонефрите, инфекционном гепатите и др.

Печень обладает значительными резервами синтезирующей способности,

поэтому выявление нарушений белкового спектра сыворотки крови при заболеваниях печени свидетельствует о глубоких гепатоцеллюлярных нарушениях.

97

Для нефротического синдрома характерна потеря большого количества альбумина в связи с нарушением фильтрационной способности почек. При этом альбумин и другие низкомолекулярные белки выходят через гломерулярные канальцы. Электрофоретическая картина при обследовании больных с патологией мочевой и мочевыводящей системы выявляет существенное снижение пика альбуминов и увеличение α1 и α2-глобулинов (рисунок 10).

Рисунок 10 – Электрофореграмма при нефротическом синдроме

Избыточная потеря альбумина и других протеинов сопутствует ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, причем клинические проявления зависят от глубины поражения и степени потери белков (рисунок 11).

98

2.4 Хроматография для разделения аминокислот в плазме крови

Хроматография — это метод разделения смесей на составляющие их вещества, основанный на различиях в степени поглощаемости отдельных веществ при прохождении их через слой поглотителя.

Хроматография используется для качественного и количественного определения веществ в различного рода смесях, в диагностических целях, а

также для препаративных целей при получении многих, в том числе и биологически активных веществ.

В клинических, санитарно-гигиенических и фармацевтических лабораториях широко применяются следующие виды хроматографии:

1) колоночная хроматография - осуществляется пропусканием исследуемого раствора, содержащего несколько растворенных веществ, через стеклянную трубку, заполненную порошкообразным поглотителем (сорбентом) (рисунок 12). Вследствие неодинаковой поглощаемости (сорбируемости)

различных веществ происходит их разделение. Чем лучше поглощается вещество, тем в более высоких частях колонки оно задерживается. Определение природы вещества производят или по собственной характерной окраске вещества, или пропусканием через колонку (после разделения смеси) раствора реагента - проявителя, образующего с анализируемыми веществами специфически окрашенные соединения. Полученный таким образом слой сорбента с различно окрашенными зонами называют хроматограммой. Вещества,

сорбированные на колонке, могут быть последовательно вытеснены (вымыты) и

собраны по фракциям. Этот процесс называют элюцией;

100