Биохимия крови. Лабораторный практикум

путь образования протромбиназы) или фактора IXа вместе с VIIIа и фосфолипидом при участии ионов кальция (внутренний, кровяной, путь образования протромбиназы);

11) фактор XI – фактор Розенталя, плазменный предшественник тромбопластина, антигемофильный фактор C. Синтезируется в печени,

термолабилен. Содержание фактора XI в плазме – около 0,005 г/л, период полураспада – 30 – 70 часов.

Активная форма этого фактора (XIа) образуется при участии факторов

XIIа, Флетчера и Фитцджеральда. Форма XIа активирует фактор IX, который превращается в фактор IXа;

12) фактор XII – фактор контакта, фактор Хагемана. Синтезируется в печени, вырабатывается в неактивном состоянии, период полураспада –

50 – 70 часов. Содержание фактора в плазме составляет около 0,03 г/л.

Кровоточивость не возникает даже при очень глубоком дефиците фактора (менее

1 %).

Активируется при соприкосновении с поверхностью кварца, стекла,

целлита, асбеста, карбоната бария, а в организме – при контакте с кожей,

волокнами коллагена, хондроитинсерной кислотой, мицеллами насыщенных жирных кислот. Активаторами фактора XII являются также фактор Флетчера,

калликреин, фактор XIа, плазмин.

Фактор Хагемана участвует во «внутреннем» пути формирования протромбиназы, активируя фактор XI;

13)фактор XIII – фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, плазменная трансглутаминаза. Определяется в сосудистой стенке, тромбоцитах,

эритроцитах, почках, легких, мышцах, плаценте. В плазме находится в виде профермента, соединенного с фибриногеном. В активную форму превращается под влиянием тромбина. В плазме содержится в количестве от 0,01 до 0,02 г/л,

период полураспада – 72 часа. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза – от 2 % до 5 %.

71

Фибринстабилизирующий фактор участвует в формировании плотного сгустка. Оказывает также влияние на адгезивность и агрегацию кровяных пластинок;

14) фактор Виллебранда – антигеморрагический сосудистый фактор.

Синтезируется эндотелием сосудов и мегакариоцитами, содержится в плазме и в тромбоцитах.

Фактор Виллебранда служит внутрисосудистым белком-носителем для фактора VIII. Связывание фактора Виллебранда с фактором VIII стабилизирует молекулу последнего, увеличивает период ее полусуществования внутри сосуда и способствует ее транспорту к месту повреждения. Другая физиологическая роль связи фактора VIII и фактора Виллебранда заключается в способности фактора Виллебранда повышать концентрацию фактора VIII в месте повреждения сосуда. Поскольку циркулирующий фактор Виллебранда связывается как с обнаженными субэндотелиальными тканями, так и со стимулированными тромбоцитами, он направляет фактор VIII в зону поражения,

где последний необходим для активации фактора X при участии фактора IXa; 15) фактор Флетчера – плазменный прекалликреин. Синтезируется в

печени. Содержание фактора в плазме составляет около 0,05 г/л. Кровоточивость не возникает даже при очень глубоком дефиците фактора (менее 1 %).

Участвует в активации факторов XII и IX, плазминогена, переводит кининоген в кинин;

16) фактор Фитцджеральда – плазменный кининоген (фактор Фложека,

фактор Вильямса). Синтезируется в печени. Содержание фактора в плазме составляет около 0,06 г/л. Кровоточивость не возникает даже при очень глубоком дефиците фактора (менее 1 %). Участвует в активации фактора XII и

плазминогена.

Эти факторы в норме циркулируют в крови в неактивной форме.

Повреждение сосудистой стенки запускает каскадную цепь реакций, в которых факторы свертывания переходят в активную форму. Сначала освобождается активатор протромбина, затем под его влиянием протромбин превращается в

72

тромбин. Тромбин, в свою очередь, расщепляет крупную молекулу растворимого глобулярного белка фибриногена на более мелкие фрагменты, которые затем вновь соединяются в длинные нити фибрина - нерастворимого фибриллярного белка. Установлено, что при свертывании 1 мл крови образуется тромбин в количестве, достаточном для коагуляции всего фибриногена в 3 литрах крови,

однако в нормальных физиологических условиях тромбин генерируется только в месте повреждения сосудистой стенки.

В зависимости от пусковых механизмов различают внешний и внутренний пути свертывания крови. Как при внешнем, так и при внутреннем пути активация факторов свертывания крови происходит на мембранах поврежденных клеток, но в первом случае запускающий сигнал, так называемый тканевой фактор - тромбопластин - поступает в кровь из поврежденных тканей сосуда.

Поскольку он поступает в кровь извне, данный путь свертывания крови называют внешним путем. Во втором случае сигнал поступает от активированных тромбоцитов, а, поскольку они являются составными элементами крови, этот путь свертывания называют внутренним. Такое разделение достаточно условно, поскольку в организме оба процесса тесно взаимосвязаны. Однако подобное разделение значительно упрощает интерпретацию тестов, используемых для оценки состояния системы свертывания крови.

Цепь превращений неактивных факторов свертывания крови в активные происходит при обязательном участии ионов кальция, в частности, превращение протромбина в тромбин. Кроме кальция и тканевого фактора, в процессе участвуют факторы свертывания VII и X (ферменты плазмы крови). Отсутствие или снижение концентрации любого из необходимых факторов свертывания крови может вызвать продолжительную и обильную кровопотерю. Нарушения в системе свертывания крови могут быть как наследственными (гемофилия,

тромбоцитопатии), так и приобретенными (тромбоцитопения). У людей после

50-60 лет содержание фибриногена в крови увеличивается, возрастает число

73

активированных тромбоцитов, происходит ряд других изменений, ведущих к повышению свертываемости крови и опасности возникновения тромбоза.

1.7.1 Определение скорости свертывания крови

Скорость свертывания крови может изменяться при ряде заболеваний в связи с изменением ее состава. Поэтому определение скорости ее свертывания имеет большое практическое значение.

Приборы.

Игла для взятия крови. Вата. Марля. Водяная баня. Термометр. Часовое стекло. Вытянутая стеклянная палочка с шариком на конце. Секундомер.

Реактивы.

Спирт этиловый, 96%-ный. Эфир диэтиловый.

Ход работы.

Кровь берется из вены уха животного, предварительно протертого ватным тампоном, смоченным смесью спирта с эфиром. Взятую каплю крови помещают на часовое стекло, которое возможно быстрее ставят на водяную баня (30 °С).

Время взятия крови регистрируют с помощью секундомера с точностью до секунды.

Через 1 мин в капле крови с помощью стеклянной палочки производят спиралеобразные движения, стремясь как бы захватить эту каплю.

Затем палочку быстро извлекают из капли, обмывают и высушивают.

Спустя 0,5 мин операцию, описанную выше, вновь повторяют, и так до тех пор,

пока на вытянутой из крови палочке не появятся ниточки фибрина. Это время и будет началом свертывания крови. Отмечается время образования сплошного сгустка, что считывается концом свертывания крови.

74

1.7.2 Определение концентрации кальция

Кальций в организме играет исключительно важную роль. Основная его масса содержится в костях в форме фосфорнокислых и отчасти углекислых и фтористых солей. Костная ткань – основное депо кальция. При понижении его уровня в крови кальций поступает в кровь связано с альбуминами в виде сложных комплексных соединений. Кальций, как двухвалентный катион,

понижает возбудимость нервной системы, уплотняет клеточную мембрану,

возбуждает сердце, активирует актомиозин, специфическую АТФ-азу,

лецитиназу и тормозит функцию дегидротаз, депептидаз и других ферментов,

способствует свертыванию крови.

Кальций непосредственно участвует в самых сложных процессах организма человека:

1)необходим для формирования костей и зубов, поддержания сердечного

ритма;

2)является составной частью ядра и мембран клеток, клеточных и тканевых жидкостей;

3)влияет на кислотно-щелочное равновесие организма;

4)активирует ряд ферментов и гормонов;

5)без него невозможны процессы деления клеток и синтез белка;

6)обеспечивает свертываемость крови;

7)играет важную роль в обмене веществ;

8)уменьшает проницаемость сосудов;

9)предотвращает ацидоз;

10)оказывает антистрессовый эффект;

11)выполняет антиоксидантные функции;

12)регулирует работу нервной системы;

13)способствует правильному формированию мышечной системы;

14)оказывает противовоспалительное действие;

75

15)активирует липазу - фермент, расщепляющий жиры;

16)участвует в регулировке силы иммунного ответа

(десенсибилизирующее действие); 17) обладает антиаллергическим действием.

Если концентрация кальция в крови менее 2,2 ммол/л, то это свидетельствует о дефиците минерала в организме. Концентрация кальция в крови может снижаться по разным причинам. Дефицит чаще встречается при заболеваниях, которые приводят к хронической потере минерала с мочой или нарушению освобождения этого вещества из костей. Очень многие низкокалорийные диеты страдают недостатком этого вещества, при этом организм начинает использовать кальций костей, волос, ногтей. Минерал активно покидает костную ткань, вследствие чего снижается плотность костной ткани, ведущая к развитию остеопороза - системного заболевания скелета,

приводящего к увеличению хрупкости костей и высокому риску их переломов.

Кроме того, с возрастом организм начинает хуже усваивать кальций.

Симптомы дефицита:

1)разрушение зубов;

2)замедление роста;

3)искривление позвоночника;

4)нарушение нормального сердечного ритма;

5)мышечные спазмы;

6)ломкость ногтей;

7)Экзема;

8)артериальная гипертензия;

9)нервозность;

10)рахит;

11)ослабление умственных способностей;

12)у пожилых женщин возможно развитие остеопороза – кости становятся настолько тонкими, что ломаются под тяжестью веса тела. Даже если концентрация кальция в крови снижена в течение длительного времени,

76

симптомы развиваются не сразу. Чрезвычайно низкая концентрация кальция

(менее 2 ммол/л) может вызывать боли и покалывание в мышцах, часто в губах,

языке, пальцах и стопах. В тяжелых случаях развиваются судороги и спазмы мышц гортани, ведущие к затруднению дыхания, а также общее напряжение и судороги мышц. Возникают изменения в проведении электрических импульсов в сердце, которые могут быть видны на электрокардиограмме. Если не вмешаться и не сбалансировать питание, то рано или поздно произойдѐт деминерализация скелета, а это чревато остеопорозом (повышенной ломкостью костей) у

взрослых. Изменение концентрации Кальция нередко обнаруживают с помощью анализа крови, поэтому дефицит минерала часто диагностируют прежде, чем симптомы становятся очевидными.

Если концентрация кальция в крови человека более 2,6 ммол/л, то это свидетельствует об избытке минерала в организме. Высокая концентрация может быть вызвана повышенным всасыванием минерала в желудочно-кишечном тракте или его избыточным поступлением в организм. Она нередко развивается у людей, которые принимают большое количество минерала (например, при язвенной болезни), а также пьют много молока. Передозировка витамина D тоже может влиять на концентрацию кальция в крови, резко увеличивая его всасывание из желудочно-кишечного тракта. Избыток кальция чаще встречается у женщин, пожилых людей и у пациентов, получивших лучевую терапию области шеи. Иногда он возникает как проявление синдрома множественной эндокринной неоплазии - редкого наследственного заболевания. Высокая концентрация минерала характерна и для больных со злокачественными опухолями, которые могут распространяться (метастазировать) в кости,

уничтожая костные клетки и способствуя выделению кальция в кровь. Это характерно для злокачественных опухолей предстательной железы, молочной железы и легкого. При других злокачественных опухолях концентрация кальция в крови повышается по причинам, еще не полностью изученным. При нарушении подвижности, например, параличах или длительном постельном

77

режиме, также может увеличиться концентрация кальция, так как костная ткань при этих состояниях теряет минерал, и он переходит в кровь.

Симптомы избытка: 1) запор;

2) потеря аппетита;

3)тошнота;

4)рвота;

5)боли в животе;

6)нарушения функций мозга (спутанность сознания, галлюцинации,

слабость);

7)нарушение сердечного ритма;

8)повреждение почек.

Способ лечения зависит от того, насколько высока концентрация кальция и от причин, вызвавших ее. При концентрации минерала не выше 2,9 ммол/л

достаточно легко устранить основную причину. Людям, у которых наблюдается тенденция к избытку, а функция почек нормальна, обычно рекомендуют пить больше жидкости. Это способствует выведению кальция через почки и помогает предотвратить обезвоживание. Если концентрация минерала очень высокая

(выше 3,7 ммол/л) или появляются симптомы нарушения функции мозга, а

функция почек нормальная, то жидкость вводят внутривенно.

Потребность в кальции варьируется в различные периоды жизни человека.

Поскольку костная масса продолжает нарастать вплоть до 25 лет, люди обоих полов в возрасте от 11 до 24 лет должны в день получать около 1200 мг кальция.

Взрослым людям обоих полов в возрасте после 25 лет следует потреблять по крайней мере 800 мг вещества в сутки, чтобы предотвратить разрушение костей.

Беременным и кормящим женщинам требуется не менее 1200 мг минерала ежедневно. Увеличивается потребность в кальции у женщин с большим риском остеопороза (у которых это наследственное заболевание), а также у людей с повышенной физической и эмоциональной нагрузкой; люди же, прикованные к постели или вовсе неподвижные в силу ранения или заболевания, должны

78

получать порядка 1500 мг в день. Младенцы, находящиеся на грудном вскармливании, потребляющие около 750 мл грудного молока, получают от 240

до 300 мг кальция в сутки и усваивают примерно 66 % его. Дополнительный прием рекомендуется при интенсивном росте, нарушении окостенения,

повышенной кровоточивости, неврозах, аллергических реакциях, туберкулезе. А

при склонности организма к повышенной свертываемости крови и образованию тромбов в кровеносных сосудах количество продуктов, богатых кальцием, в

рационе должно быть снижено.

Принцип метода.

Кальций осаждается из сыворотки в виде оксалата. Осадок промывают,

затем растворяют его в серной кислоте и освободившуюся щавелевую кислоту титруют раствором марганцевокисслого калия.

Реакции протекают в следующей последовательности:

1)CaCl2 +(NH4)CO2 → CaC2O4 + 2NH4Cl,

2)CaC2O4 + H2SO4 → Ca2SO4 + H2C2O4,

3)5H2C2O4 + 2KMnO4 + 3H2SO4 →2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 10CO2.

Из приведенных реакций видно, что количество марганцевокислого калия,

пошедшее на окисление щавелевой кислоты, эквивалентно количеству кальция.

Приборы.

Центрифуга. Центрифужные весы. Штатив с центрифужными пробирками.

Пипетки на 2 мл – 2 шт. Пипетки на 10 мл с делениями. Стеклянные палочки.

Микробюретка. Водяная баня.

Реактивы.

Оксалат аммония, 4%-ный раствор. Аммиак, 2%-ный раствор. Серная кислота, 1 н. раствор. Марганцевокислый калий, 0,01 н. раствор.

Ход работы.

В две центрифужные пробирки наливают по 1 мл сыворотки крови и 1 мл дистиллированной воды, в третью (контрольную) – 2 мл дистиллированной

79

воды. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора щавелевокислого аммония.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин.

Через 30 мин содержимое пробирок центрифугируют 10 мин при 2500 – 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл 2%-

ного раствора аммиака и содержимое пробирки центрифугируют вновь.

Надосадочную жидкость сливают в том же порядке. Промывание осадка аммиаком повторяют еще раз. Последняя порция надосадочной жидкости сливается возможно полнее, а осадок используется в дальнейших реакциях.

Осадок растворяют в 2 мл 1 н. раствора серной кислоты, затем пробирки ставят в горячую водяную баню и через 3-5 мин горячий раствор титруют 0,01 н.

раствором перманганата при постоянном помешивании стеклянными палочками до появления бледно-розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.

Расчет:

где х – содержание кальция, мг %; 0,2 – количество кальция, мг, соответствующее 1 мл 0,01 н. перманганата;

a – количество перманганата (мл), пошедшего на титрование пробы (опыт); b – то же (контроль); 100 – пересчет в мг%.

Например: на титрование опытных проб пошло в среднем 0,72 мл 0,01 н.

раствора перманганата, на титрование контроля – 0,15 мл, тогда х = 0,2*(0,72-0,15)*100; х = 11,4 мг %.

80