Биохимия крови. Лабораторный практикум

6)сепсис;

7)острые инфекционные заболевания;

8)терминальная стадия цирроза печени, рак печени;

9)хронические заболевания легких, туберкулез легких.

Низкий холестерин характерен для людей, чья пища бедна насыщенными жирами и холестерином. Низкий уровень холестерина крови наблюдается вследствие приема некоторых медицинских препаратов (эстрогенов и др.).

1.6.1 Определение холестерола в сыворотке крови

Метод основан на способности холестерола давать изумрудно-зеленое окрашивание под действием концентрированной серной кислоты, уксусного ангидрида и ледяной уксусной кислоты. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию холестерола в пробе и используется для колориметрического определения.

Преимущество данного метода – возможность проведения определения без предварительной экстракции других липидов, что значительно сокращает время анализа.

Приборы.

Фотоколориметр. Водяная баня. Термометр. Штатив с пробирками.

Пипетки на 0,1 и 0,5 мл. Колба мерная на 100 мл.

Реактивы.

Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1) (реактив 1). При смешивании ингредиентов избегают нагревания смеси. Для этого колбу, где приготовляется реактив, постоянно охлаждают (помещая колбу в сосуд со льдом), серную кислоту добавляют в последнюю очередь каплями и при постоянном помешивании. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтого цвета и может

61

длительно сохраняться в холодильнике. Стандартный раствор холестерола

(реактив 2). Хлороформ.

Ход работы.

К 2 мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки,

встряхивают короткими энергичными движениями раз 100 и помещают в темное место на 20 мин. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют в

фотоэлектроколориметре, применяя красный светофильтр

(длина волны 650-660 нм) и кюветы диаметром 0,5 см.

При постановке реакции нужно пользоваться абсолютно чистыми и сухими пробирками и пипетками. Соотношение ингредиентов реактива рассчитано так,

что белки сыворотки не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано только наличием воды в реактиве или посуде.

Расчет производят по общим правилам с учетом концентрации стандартного раствора. Для приготовления стандартного раствора 90 мг холестерола растворяют в 100 мл хлороформа. Рабочий раствор получают растворением стандартного раствора в 10 раз (10 мл стандартного раствора растворяют в хлороформе, доводя до метки 100 мл). 1 мл стандартного раствора соответствует 0,9 мг холестерола.

Построение калибровочного графика на холестерол:

Все пробирки с рабочим раствором различной концентрации выпаривают досуха на водяной бане, затем прибавляют 2,2 мл реактива 1. Колориметрируют

62

на ФЭКе при красном светофильтре с кюветой 0,5 см через 20 мин после прибавления реактива и стояния в темноте.

На основании данных колориметрирования рабочих растворов строят калибровочную кривую по обычному способу. Зная оптическую плотность исследуемого раствора сыворотки крови, находят по калибровочной кривой соответствующую ей концентрацию.

1.6.2 Количественное определение холестерола в сыворотке крови (по Ильку)

Приборы.

Фотоэлектроколориметр. Баня водяная. Штатив с пробирками.

Микропипетка на 0,2 мл. Пипетка на 5 мл с делениями.

Реактивы.

Сыворотка крови, негемолизированная. Реактив на холестерол

(приготовление: в колбе при постоянном взбалтывании и охлаждении смешивают одну часть ледяной уксусной кислоты, пять частей уксусного ангидрида и одну часть концентрированной серной кислоты. Серную кислоту приливают малыми порциями в последнюю очередь).

Ход работы.

При проведении этой работы пользуются сухими пробирками и пипетками.

В пробирку помещают 4,2 мл реактива на холестерол и добавляют 0,2 мл негемолизированной сыворотки крови таким образом, чтобы она стекала по стенке пробирки. Пробирку сразу часто и сильно встряхивают не менее 10 раз и затем ставят в темное место на 20 мин при комнатной температуре для развития окраски смеси.

63

Интенсивность зеленого окрашивания опытной пробы измеряют с помощью фотоэлектроколориметра с красным сфетофильтром в кювете с рабочей длиной 5 мм.

Концентрацию холестерола в сыворотке крови находят по стандартной кривой, на которой каждому значению экстинкции опытного раствора соответствует определенное содержание холестерола в мг%.

Для построения стандартной кривой в пробирки вносят соответственно 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3,0 мл стандартного раствора, содержащего 0,09 мг холестерола в 1 мл хлороформа, выпаривают его досуха на водяной бане и затем проводят те же операции, что и с опытным раствором. Полученные данные оптической плотности растворов холестерола известной концентрации используют для построения стандартной кривой.

1.6.3 Гравиметрическое определение общих липидов в сыворотке крови

Метод основан на извлечении липидов алкогольно-эфирной смесью с последующим испарением растворителя и определения массы сухого остатка.

Приборы.

Водяная баня. Воронка. Пипетки на 1 и 2 мл. Фильтровальная бумага.

Стаканчик. Мерные колбы на 25 мл.

Реактивы.

Смесь эфира и этилового спирта 1:3. Петролейный эфир. Хлороформ.

Свежая сыворотка крови.

Ход работы.

К 20 мл эфирно-алкогольной смеси прибавляют каплями из пипетки

1,25 мл сыворотки крови и нагревают в течение 5 мин на кипящей водяной бане.

Фильтруют в мерную колбу. Фильтрат промывают эфирно-алкогольной смесью и объем доводят до 25 мл, 20 мл этой смеси, равной 1 мл сыворотки, испаряют на водяной бане. Остаток растворяют в петролейном эфире или хлороформе и

64

фильтруют в предварительно взвешенный стаканчик. Промывают фильтр три раза небольшими количествами петролейного эфира или хлороформа. Снова испаряют досуха, высушивают при 70 °С и взвешивают стаканчик. Разница между результатом двух взвешиваний, умножая на 100, показывает концентрацию жиров в крови.

1.7 Лабораторная работа № 7. Определение скорости свертывания

крови

Свертывающая система состоит из трех компонентов:

1) свертывающая система - отвечает за процессы свертывания (коагуляции)

крови;

2)противосвертывающая система - отвечает за процессы, препятствующие свертыванию (антикоагуляции) крови;

3)фибринолитическая система - отвечает за процессы фибринолиза

(растворения образовавшихся тромбов).

В нормальном состоянии все эти три системы находятся в состоянии равновесия, давая крови беспрепятственно циркулировать по сосудистому руслу.

Нарушение такой равновесной системы (гемостаза) в организме приводит к патологическому тромбообразованию, или повышенной кровоточивости.

Нарушение гемостаза наблюдается при многих заболеваниях внутренних органов: ишемической болезни сердца, ревматизме, сахарном диабете,

заболеваниях печени, злокачественных новообразованиях, острых и хронических заболеваниях легких и проч.

Свертывание крови - жизненно важное физиологическое приспособление.

Образование тромба при нарушении целостности сосуда - это защитная реакция организма, направленная на предохранение от кровопотери. Механизмы образования кровоостанавливающего тромба и патологического тромба

(закупоривающего кровеносный сосуд, питающий внутренние органы) очень

65

схожи. Весь процесс свертывания крови можно представить как цепь взаимосвязанных реакций, каждая из которых заключается в активации веществ,

необходимых для следующего этапа.

Процесс свертывания крови находится под контролем нервной и гуморальной системы, и непосредственно зависит от согласованного взаимодействия по меньшей мере 12 специальных факторов (белков крови).

В современной схеме свертывания крови выделяют четыре фазы:

1)протромбинообразование – 5 - 7 минут;

2)тромбинообразование – 2 - 5 секунд;

3)фибринообразование – 2 - 5 секунд;

4)посткоагуляционная фаза (образование гемостатически полноценного сгустка) – 55 - 85 минут.

Уже через доли секунды после повреждения стенки сосуда в зоне травмы наблюдается спазм сосудов, и развивается цепь тромбоцитарных реакций, в

результате которых образуется тромбоцитарная пробка. Прежде всего,

происходит активация тромбоцитов факторами, выделяющимися из поврежденных тканей сосуда, а также малыми количествами тромбина -

фермента, образующегося в ответ на повреждение. Затем происходит склеивание

(агрегация) тромбоцитов друг с другом и с фибриногеном, содержащимся в плазме крови, и одновременное прилипание (адгезия) тромбоцитов к коллагеновым волокнам, находящимся в стенке сосуда, и поверхностным адгезивным белкам клеток эндотелия. В процесс вовлекается все большее и большее число тромбоцитов, поступающих в зону повреждения. Первая стадия адгезии и агрегации обратима, но позже эти процессы становятся необратимыми.

Агрегаты тромбоцитов уплотняются, образуя пробку, плотно закрывающую дефект в сосудах малого и среднего размера. Из адгезированных тромбоцитов высвобождаются факторы, активирующие все клетки крови и некоторые факторы свертывания, находящиеся в крови, в результате чего на основе тромбоцитарной пробки формируется фибриновый сгусток. В сети фибрина задерживаются форменные элементы крови и в результате образуется

66

кровяной сгусток. Позднее из сгустка вытесняется жидкость, и он превращается в тромб, который препятствует дальнейшей потере крови, он же является барьером для проникновения патогенных агентов.

Такая тромбоцитарно-фибриновая гемостатическая пробка может противостоять повышенному кровяному давлению после восстановления тока крови в поврежденных сосудах среднего размера. Механизм прилипания тромбоцитов к эндотелию сосудов в зонах с малой и большой скоростью тока крови различается набором так называемых адгезивных рецепторов - белков,

расположенных на клетках кровеносных сосудов. Генетически обусловленное отсутствие или снижение числа таких рецепторов приводит к развитию геморрагического диатеза (кровоточивости).

Плазменный гемостаз осуществляется в основном белками, называемыми плазменными факторами свертывания крови. Плазменные факторы свертывания крови – это прокоагулянты, активация и взаимодействие которых приводят к образованию сгустка фибрина.

По Международной номенклатуре плазменные факторы свертывания крови обозначаются римскими цифрами, за исключением факторов Виллебранда, Флетчера и Фитцджеральда. Для обозначения активированного фактора к этим цифрам добавляется буква «а». Помимо цифрового обозначения,

используют и другие наименования факторов свертывания – по их функции

(например, фактор VIII – антигемофильный глобулин), по фамилиям больных с впервые обнаруженным дефицитом того или иного фактора (фактор XII – фактор Хагемана, фактор X – фактор Стюарта-Прауэра), реже – по фамилиям авторов

(например, фактор Виллебранда).

Ниже приведены основные факторы свертывания крови и их синонимы по международной номенклатуре и основные их свойства в соответствии с данными литературы и специальных исследований.

Номенклатура плазменных факторов свертывания крови:

1) фактор I – фибриноген. Синтезируется в печени и клетках ретикулоэндотелиальной системы (в костном мозге, селезенке, лимфатических

67

узлах и т. д.). В легких под действием особого фермента – фибриногеназы или фибринодеструктазы – происходит разрушение фибриногена. Содержание фибриногена в плазме от 2 до 4 г/л, период полураспада – 72 – 120 часов.

Минимальный уровень, необходимый для гемостаза составляет 0,8 г/л.

Под влиянием тромбина фибриноген превращается в фибрин, который образует сетчатую основу тромба, закупоривающего поврежденный сосуд;

2) фактор II – протромбин. Протромбин синтезируется в печени при участии витамина K. Содержание протромбина в плазме – около 0,1 г/л, период полураспада – 48 – 96 часов.

Уровень протромбина, или его функциональная полноценность, снижается при эндогенной или экзогенной недостаточности витамина K, когда образуется неполноценный протромбин. Скорость свертывания крови нарушается лишь при концентрации протромбина ниже 40 % от нормы

В естественных условиях при свертывании крови под действием тромбопластина и ионов кальция, а также при участии факторов V и Xа (активированного фактора X), объединяемых общим термином

«протромбиназа», протромбин превращается в тромбин. Процесс превращения протромбина в тромбин довольно сложен, так как во время реакции образуется ряд дериватов протромбина, аутопротромбинов и, наконец, различных типов тромбина (тромбина C, тромбина E), которые обладают прокоагулянтной,

антикоагулянтной и фибринолитической активностью. Образующийся тромбин

C - основной продукт реакции – способствует свертыванию фибриногена;

3) фактор III – тканевой тромбопластин. Тканевой тромбопластин представляет собой термостабильный липопротеид, имеется в различных органах – в легких, мозге, почках, сердце, печени, скелетных мышцах. В тканях содержится не в активном состоянии, а в виде предшественника – протромбопластина. Тканевой тромбопластин при взаимодействии с плазменными факторами (VII, IV) способен активировать фактор X, участвует во внешнем пути формирования протромбиназы – комплекса факторов,

превращающих протромбин в тромбин;

68

4) фактор IV – ионы кальция. В норме содержание фактора IV в плазме составляет от 0,09 до 0,1 г/л (от 2,3 до 2,75 ммоль/л). В процессе свертывания он не расходуется. Поэтому его можно обнаружить в сыворотке крови. Процесс свертывания остается нормальным даже при снижении концентрации кальция,

при котором наблюдается судорожный синдром.

Ионы кальция участвуют во всех трех фазах свертывания крови: в

активации протромбиназы (I фаза), превращении протромбина в тромбин (II

фаза) и фибриногена в фибрин (III фаза). Кальций способен связывать гепарин,

благодаря чему свертывание крови ускоряется. При отсутствии кальция

нарушаются агрегация тромбоцитов и ретракция кровяного сгустка. Ионы кальция ингибируют фибринолиз;

5) фактор V – проакцелерин, плазменный AC-глобулин, или лабильный

фактор. Образуется в печени, но, в отличие от других печеночных факторов протромбинового комплекса (II, VII, и X) не зависит от витамина K. Легко

разрушается. Содержание фактора V в плазме – от 12 до 17 ед/мл

(около 0,01 г/л), период полураспада – 15 – 18 часов. Минимальный уровень,

необходимый для гемостаза – от 10 % до 15%.

Фактор V необходим для образования внутренней (кровяной)

протромбиназы (активирует фактор X) и для превращения протромбина в тромбин;

6) фактор VI – акцелерин, или сывороточный AC-глобулин – активная форма фактора V. Исключен из номенклатуры факторов свертывания,

признается лишь неактивная форма фермента – фактор V (проакцелерин),

который при появлении следов тромбина переходит в активную форму;

7) фактор VII – проконвертин – конвертин. Синтезируется в печени при участии витамина K. Долго остается в стабилизированной крови, активируется смачиваемой поверхностью. Содержание фактора VII в плазме - около 0,005 г/л,

период полураспада – 4 – 6 часов. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза – от 5 % до 10 %.

69

Конвертин – активная форма фактора – играет основную роль в образовании тканевой протромбиназы и в превращении протромбина в тромбин.

Активация VII фактора происходит в самом начале цепной реакции при контакте с чужеродной поверхностью. В процессе свертывания проконвертин не потребляется и сохраняется в сыворотке;

8) фактор VIII – антигемофильный глобулин А. Вырабатывается в печени,

селезенке, клетках эндотелия, лейкоцитах, почках. Содержание фактора VIII в

плазме – от 0,01 до 0,02 г/л, период полураспада – 7 – 8 часов. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза – от 30 % до 35 %.

Антигемофильный глобулин А участвует во «внутреннем» пути формирования протромбиназы, усиливая активирующее действие фактора IXа (активированного фактора IX) на фактор X. Фактор VIII циркулирует в крови,

будучи связанным с фактором Виллебранда;

9)фактор IX – фактор Кристмаса, антигемофильный глобулин B.

Образуется в печени при участии витамина K, термостабилен, длительно сохраняется в плазме и сыворотке крови. Содержание фактора IX в плазме составляет около 0,003 г/л. Период полураспада – 7 – 8 часов. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза – от 20 % –до 30 %.

Антигемофильный глобулин B участвует во «внутреннем» пути формирования протромбиназы, активируя в комплексе с фактором VIII, ионами кальция и фактором 3 тромбоцитов фактор X;

10) фактор X – фактор Стюарта-Прауэра. Вырабатывается в печени в неактивном состоянии, активируется трипсином и ферментом из яда гадюки. K-

витаминозависим, относительно стабилен, период полураспада – 30 – 70 часов.

Содержание фактора X в плазме составляет около 0,01 г/л. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза – от 10 % до 20 %.

Фактор X участвует в образовании протромбиназы. В современной схеме свертывания крови активный фактор X (Xа) является центральным фактором протромбиназы, превращающей протромбин в тромбин. В активную форму фактор X превращается под действием факторов VII и III (внешний, тканевой,

70