Биохимия крови. Лабораторный практикум

электрофорезе в полиакриламидном или крахмальном гелях в плазме крови выделяют 16 - 17 белковых фракций. Метод иммуноэлектрофореза, сочетающий электрофоретический и иммунологический способы анализа, позволяет разделить белки плазмы крови более чем на 30 фракций.

Большинство сывороточных белков синтезируется в печени, однако некоторые образуются и в других тканях. Например, γ-глобулины синтезируются В-лимфоцитами, пептидные гормоны в основном секретируют клетки эндокринных желѐз, а пептидный гормон эритропоэтин - клетки почки.

Для многих белков плазмы, например альбумина, α1-антитрипсина,

гаптоглобина, транс-феррина, церулоплазмина, α2-макроглобулина и иммуноглобулинов, характерен полиморфизм.

Почти все белки плазмы, за исключением альбумина, являются гликопротеинами. Олигосахариды присоединяются к белкам, образуя гликозидные связи с гидроксильной группой серина или треонина, или взаимодействуя с карбоксильной группой аспарагина. Концевой остаток олигосахаридов в большинстве случаев представляет собой N-

ацетилнейраминовую кислоту, соединѐнную с галактозой. Фермент эндотелия сосудов нейраминидаза гидролизует связь между ними, и галактоза становится доступной для специфических рецепторов гепатоцитов. Путѐм эндоцитоза

"состарившиеся" белки поступают в клетки печени, где разрушаются.

При ряде заболеваний происходит изменение соотношения распределения белковых фракций при электрофорезе по сравнению с нормой (рисунок 5).

Такие изменения называют диспротеинемиями, однако их интерпретация часто имеет относительную диагностическую ценность. Например, характерное для нефротического синдрома снижение альбуминов, α1- и γ-глобулинов и увеличение α2- и β-глобулинов отмечают и при некоторых других заболеваниях,

сопровождающихся потерей белков. При снижении гуморального иммунитета уменьшение фракции γ-глобулинов свидетельствует об уменьшении содержания основного компонента иммуноглобулинов - IgG, но не отражает динамику изменений IgA и IgM.

41

Содержание некоторых белков в плазме крови может резко увеличиваться при острых воспалительных процессах и некоторых других патологических состояниях (травмы, ожоги, инфаркт миокарда). Такие белки называют белками острой фазы, так как они принимают участие в развитии воспалительной реакции организма. Основной индуктор синтеза большинства белков острой фазы в гепатоцитах - полипептид интерлейкин-1, освобождающийся из мононуклеарных фагоцитов. К белкам острой фазы относят С-реактивный белок,

называемый так, потому что он взаимодействует с С-полисахаридом пневмококков, α1-антитрипсин, гаптоглобин, кислый гликопротеин, фибриноген.

Известно, что С-реактивный белок может стимулировать систему комплемента,

и его концентрация в крови, например, при обострении ревматоидного артрита может возрастать в 30 раз по сравнению с нормой. Белок плазмы крови α-

антитрипсин может инактивировать некоторые протеазы, освобождающиеся в острой фазе воспаления.

Рисунок 4- Электрофореграмма белков сыворотки крови

42

между сосудистым руслом и межклеточным пространством. Клинически это проявляется как отѐк. Относительное снижение объѐма плазмы крови сопровождается снижением почечного кровотока, что вызывает стимуляцию системы ренинангиотензинальдрстерон, обеспечивающей восстановление объѐма крови. Однако при недостатке альбумина, который должен удерживать

Na+, другие катионы и воду, вода уходит в межклеточное пространство, усиливая отѐки.

Гипоальбуминемия может наблюдаться и в результате снижения синтеза альбуминов при заболеваниях печени (цирроз), при повышении проницаемости капилляров, при потерях белка из-за обширных ожогов или катаболических состояний (тяжѐлый сепсис, злокачественные новообразования), при нефротическом синдроме, сопровождающемся альбуминурией, и голодании.

Нарушения кровообращения, характеризующиеся замедлением кровотока,

приводят к увеличению поступления альбумина в межклеточное пространство и появлению отѐков. Быстрое увеличение проницаемости капилляров сопровождается резким уменьшением объѐма крови, что приводит к падению артериального давления и клинически проявляется как шок.

Альбумин - важнейший транспортный белок. Он транспортирует свободные жирные кислоты, неконъюгированный билирубин, Са2+, Сu2+,

триптофан, тироксин и трийодтиронин. Многие лекарства (аспирин, дикумарол,

сульфаниламиды) связываются в крови с альбумином. Этот факт необходимо учитывать при лечении заболеваний, сопровождающихся гипоальбуминемией,

так как в этих случаях повышается концентрация свободного лекарства в крови.

Кроме того, следует помнить, что некоторые лекарства могут конкурировать за центры связывания в молекуле альбумина с билирубином и между собой.

Транстиретин (преальбумин) называют тироксинсвязывающим преальбумином. Это белок острой фазы. Транстиретин относят к фракции альбуминов, он имеет тетрамерную молекулу. Он способен присоединять в одном центре связывания ретинолсвязывающий белок, а в другом - до двух молекул тироксина и трийодтиронина.

44

Соединение с этими лигандами происходит независимо друг от друга. В

транспорте последних транстиретин играет существенно меньшую роль по

сравнению с тироксинсвязывающим глобулином.

α1 - Антитрипсин относят к α1-глобулинам. Он ингибирует ряд протеаз, в

том числе фермент эластазу, освобождающийся из нейтрофилов и разрушающий эластин альвеол лѐгких. При недостаточности α1-антитрипсина могут возникнуть эмфизема лѐгких и гепатит, приводящий к циррозу печени. Существует несколько полиморфных форм α1-антитрипсина, одна из которых является патологической. У людей, гомозиготных по двум дефектным аллелям гена антитрипсина, в печени синтезируется α1-антитрипсин, который образует агрегаты, разрушающие гепатоциты. Это приводит к нарушению секреции

такого белка гепатоцитами и к снижению содержания α1-антитрипсина в крови.

Гаптоглобин составляет примерно четверть всех α2-глобулинов.

Гаптоглобин при внутрисосудистом гемолизе эритроцитов образует комплекс с гемоглобином, который разрушается в клетках эндоплазматической сети. Если свободный гемоглобин, имеющий молекулярную массу 65 кД, может фильтроваться через почечные клубочки или агрегировать в них, то комплекс

гемоглобин - гаптоглобин имеет слишком большую молекулярную массу

(155 кД), чтобы пройти через гломерулы. Следовательно, образование такого комплекса предотвращает потери организмом железа, содержащегося в гемоглобине. Определение содержания гаптоглобина имеет диагностическое значение, например, снижение концентрации гаптоглобина в крови наблюдают при гемолитической анемии. Это объясняют тем, что при периоде

полураспада гаптоглобина, составляющем 5 дней, и периоде

полураспада комплекса гемоглобин - гаптоглобин (около 90 мин) увеличение поступления свободного гемоглобина в кровь при гемолизе эритроцитов вызовет резкое снижение содержания свободного гаптоглобина в крови.

Гаптоглобин относят к белкам острой фазы, его содержание в крови повышается при острых воспалительных заболеваниях.

Принцип метода, реактивы и ход работы см. ниже.

45

1.4.5 Электрофорез белков на бумаге

Белки сыворотки крови отдельных тканей гетерогенны по своему составу,

строению и функциям. Для их разделения на отдельные фракции используют различные методы, в том числе и электрофорез на бумаге.

Воснову этого метода положен следующий принцип. Каждый белок несет

всебе свободный электрический заряд и может перемещаться с различной скоростью в электрическом поле. Величина электрического заряда является индивидуальной характеристикой каждого белка, но она зависит и от окружающей среды, в первую очередь от pH, ионной силы раствора.

Если полосу фильтровальной бумаги смочить буферным раствором,

укрепить между полюсами электрического поля, нанести на нее смесь белков и подключить источник электрического тока, то молекулы белка будут мигрировать по фильтровальной бумаге в сторону полюса, заряд которого противоположен заряду белка. Скорость миграции молекул белка пропорциональна величине их свободного заряда и градиенту потенциала электрического поля.

Картина, полученная в результате разделения белков на бумаге, обычно выявляется при помощи красителей, специфически соединяющихся с белками

(кислый сине-черный, бромфеноловый синий и др.)

Приборы.

Камера для электрофореза на бумаге. Источник постоянного тока силой до

20 мА и напряжением до 300 В. Электрофотоколориметр. Штатив с пробирками.

Микропипетка. Сушильный шкаф. Кювета 25х30 см. Пинцет.

Реактивы.

Хроматографическая бумага, полосы 3х26 см (30 см).

Буферные растворы:

а) вероналовый буфер pH 8,6 (10,32 г мединала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, добавляют 1,84 г веронала и нагревают на водяной бане

46

до полного растворения веронала, после чего объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 л);

б) борно-боратный буфер pH 8,6 (5,57 г борной кислоты и 10,49 г буры растворяют в 700 мл дистиллированной воды и доводят водой до 1 л);

в) трис-буфер pH 8,9 (60,5 г триоксиметиламинометана, 6,02 г

этилендиаминочетырехуксусной кислоты и 4,6 г борной кислоты растворяют в 1 л дистиллированной воды).

Краситель для обработки электропротеинограмм:

а) кислый сине-черный (0,2 г), ледяная уксусная кислота (100 мл), метанол

(900 мл);

б) бромфенол синий (0,5 г), сулема (10 г), ледяная уксусная кислота(20 мл),

дистиллированная вода (980 мл);

в) бромфенол синий (0,1 г), сульфат цинка водный (50 г), ледяная уксусная кислота (50 мл), вода дистиллированная (900 мл);

Растворы для отмывания избытка краски, не связавшейся с белком:

а) уксусная кислота, 2%-ный раствор;

б) уксусная кислота, 10%-ная с 4% расплавленного фенола;

в) этанол 50%-ный.

Растворы для элюции краски:

а) гидроксид натрия, 0,01 н. раствор (для бромфенолового синего);

б) гидроксид натрия, 0,1 н. раствор (для кислого сине-черного).

Ход работы.

Электродные кюветы камеры заполняют буферным раствором и их отделения соединяют между собой кусочками фильтровальной бумаги.

Смачивают полосы хроматографической бумаги в буфере, удаляя избыток последнего промоканием между листами фильтровальной бумаги, затем концы полос хроматографической бумаги опускают в противоположные электродные камеры. Укрепляют их при помощи грузиков в строго горизонтальном положении. Бумажные полосы можно устанавливать и сухими, давая им возможность пропитаться буферным раствором.

47

На установленные полосы хроматографической бумаги при помощи микропипетки наносят от 0,01 до 0,03 мл сыворотки, отступя на 8 - 9 см от катодного конца полосы. После этого камеру герметически закрывают и подключают к источнику постоянного тока. Электрофорез осуществляется при градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см полосы. При длине полос от 26 до

30 см это составляет от 180 до 200 В. Сила тока при этом не должна превышать

0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы.

По окончании электрофореза камеру отключают от блока питания,

извлекают из нее полосы фильтровальной бумаги и высушивают их в сушильном шкафу при температуре от 102 до 105 °С в течение 15-20 мин. Высушенные электрофореграммы окрашивают, погружая их на 30 мин в бромфеноловый синий с сернокислым цинком. Избыток краски отмывают 2%-ным раствором уксусной кислоты, сменяя ее 4-5 раз.

Для определения соотношения между фракциями белков полосу разрезают по границам окрашенных участков, каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают раствором щелочи. Через 30 мин элюаты колориметрируют на ФЭКе. Контролем при этом служит элюат из неокрашенных участков электрофореграмм. Значения экстинкций по каждой фракции суммируют и сумму принимают за 100 %, далее вычисляют процентное содержание каждой фракции.

1.4.6 Электрофорез белков на агар-агаре

В геле агар-агара размеры пор относительно большие, что позволяет белкам свободно мигрировать в нем под действием электрического тока. При этом как носитель он лучше бумаги: из него меньше испаряется вода в процессе электрофореза, не наблюдаются капиллярные явления, что устраняет возможность искажения картины электрофореграмм. Из агар-агара можно готовить блоки различной толщины и плотности, они довольно прочные и

48

прозрачны, что позволяет их фотометрировать без предварительного элюирования краски.

Приборы.

Камера электрофореза с блоком питания. Стеклянные пластинки

(25х180 мм). Микропипетка. Сушильный шкаф. Кювета 25х30 см. Ножницы.

Пинцет.

Реактивы.

Раствор агар-агара на буфере, 1%-ный. (Выпускаемый промышленностью агар-агар отмывают дистиллированной водой в течение суток, растворяют в горячем буферном растворе, фильтруют, разливают тонким слоем на предварительно вымытые и обезжиренные стеклянные пластинки, подкладывая на короткие края последних полосы фильтровальной бумаги по ширине стекла и длиной от 60 до 70 мм). Мединал-вероналовый буфер с pH 8,6. Раствор уксусной кислоты в 60%-ном этаноле, 2%-ный. Бромфеноловый синий краситель. Раствор уксусной кислоты, 26%-ный. Раствор ацетата натрия в 10%-ном растворе уксусной кислоты, 2%-ный.

Ход работы.

После нанесения агар-агара на пластинки дают ему застыть в течение 1 ч

при комнатной температуре. Затем их помещают в камеру для электрофореза,

опуская полосы фильтровальной бумаги, подложенные под гель, в электродные кюветы. Раствор белка (сыворотка крови) в количестве от 0,01 до 0,05 мл предварительно наносят на полосы фильтровальной бумаги (2х20 мм), которые пинцетом помещают на агар-агар по центру пластинки. Камеру закрывают и подключают к блоку питания. Электрофорез проводят при напряжении от 150 до

170 В и силе тока от 1,3 до 1,6 мА на каждый сантиметр поперечного сечения агар-агаровых блоков в течение 6 ч. По окончании электрофореза пластинку освобождают от фильтровальной бумаги, фиксируют в спиртовом растворе уксусной кислоты в течение 6 ч. Высушивают при 37 °С и окрашивают в течение

18 ч. Окрашенные пластинки промывают трижды в 2%-ном растворе уксусной кислоты по 5-10 мин и один раз в растворе ацетата натрия в 10%-ной уксусной

49

кислоте. Снова высушивают и фотометрируют в денситометре для расшифровки электрофореграмм.

1.4.7 Индикан

В толстом кишечнике под влиянием бактериальных процессов аминокислота триптофан подвергается разложению с образованием индола.

Последний всасывается в кровь воротной вены и в печени обезвреживается,

соединяясь после с серной или глюкуроновой кислотой:

Вничтожном количестве индикан содержится в любой нормальной моче.

Вмоче лошади индикана много всегда. Повышение содержания индикана имеет важное диагностическое значение при различных формах кишечной непроходимости.

Принцип метода.

Обнаружение индикана в моче, основанное на том принципе, что находящиеся в моче индоксилсерная и индоксилглюкуроновая кислоты при прибавлении крепкой соляной кислоты разлагаются на свои составные части и освободившийся при этом индоксил окисляется KMnO4 в синее индиго,

растворимое в хлороформе. При нормальном содержании индикана хлороформ имеет бледно-синюю окраску с фиолетовым оттенком, при резко повышенном – густо синюю окраску с фиолетовым оттенком.

Приборы.

Штатив с пробирками.

50