Биохимия крови. Лабораторный практикум

реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (рисунок 14).

Рисунок 14 – Способы регистрации глюкозооксидазной реакции

Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-

радикала – О2-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.

111

На рисунках 15 и 16 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм.

Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны от 480 до 520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 15 - Спектр рабочего раствора

Рисунок 16 – Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно

112

реализовать как с применением обычного фотометра, так и с

помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Глюкозооксидазный метод признан сегодня одним из самых точных количественных методов определения глюкозы. В качестве биологического материала используется как сыворотка крови, так и цельная кровь. При работе с последней следует учитывать тот факт, что при взятии капиллярной крови доля сыворотки (плазмы) зависит от величины гематокрита, что может негативно отразиться на точности результата. Поэтому при определении глюкозы вышеописанным методом предпочтительно использовать сыворотку крови

пациента.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет

назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод

фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.

Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра,

полуавтоматических анализаторов или автоматических биохимических

анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц.

Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной

(рисунок 17).

113

разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры,

которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Глюкометры предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса.

Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Рисунок 18 – Конструкция тест-полоски

Мембрана тест-полоски напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует:

1)как резервуар, собирая необходимое количество крови;

2)как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты,

лейкоциты и др.); 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный

свет.

Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать

(промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

115

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами,

благодаря которым капля крови притягивается к поверхности тест-полоски при касании.

В состав приборов входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-

полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: «ждать». Когда капля крови наносится на тест-полоску,

плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер.

Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16–ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти

16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора.

116

Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

2.6.2 Гексокиназный метод

Гексокиназный метод состоит из двух последовательных реакций, но совершенно других:

Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.

117

Список использованных источников

1. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф Коровкин. – Изд.

3-е.– М.: Медицина, 1998. – 528с.

2.Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т.Березов, Б.Ф. Коровкин. – 2-е

изд. – М.: Медицина, 1990. – 548с.

3.Биохимия: учеб. для студентов мед. вузов / под ред. Е. С. Северина.- 5-е

изд. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 766 с. - ISBN 978-5-9704-1195-7.

4.Кнорре, Д.Г. Биологическая химия: учеб. для хим., биол., и мед. спец. вузов / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. – М.: Высш. шк., 2000. – 479 с.

5.Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рѐм: пер. с нем. – 3-

еизд. – М.: Мир; БИОНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 469 с. - ISBN 978-5- 9963-0126-3 (БИОНОМ. ЛЗ), ISBN 978-5-03-003811-7 (Мир).

6.Комов, В. П. Биохимия: учеб. для вузов / В. Т. Комов, В. Н. Шведова .- 3-е изд., стер. - М.: Дрофа, 2008. - 640 с. - (Высшее образование: Современный учебник). - ISBN 978-5-358-04872-0.

7.Биологическая химия / В.К.Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович. – Минск: Асар, 2008. – 688с.

8.Рогожин, В. В. Практикум по биологической химии : учеб.-метод. пособие / В. В. Рогожин. - СПб. : Лань, 2006. - 256 с. - ISBN 5-8114-0679-7.

9.Российская Федерация. СанПин 2.1.3.2630-10. Санитарно-

эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность: СанПин РФ от 18.05.2010 г. № 58 / Минюст РФ. –

М.: Аст, 2012. – 224с. - ISBN: 978-5-4252-0607-7.

10.Российская Федерация. СанПин 2.1.7.2790-10. Санитарно-

эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами:

СанПин РФ от 9.12.2010 г. № 163 / Минюст РФ. – М.: Аст, 2012. – 32с. -

ISBN: 978-5-4252-0606-0

11. Степаненко, Б. Н. Химия и биохимия углеводов: моносахариды: учеб. пособие для вузов / Б. Н. Степаненко. - М. : Высш. шк., 1977. - 224 с.

118

12. Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия: учебн. для вузов / Н.А.

Тюкавкина, Ю.И. Бауков. – М.: Дрофа, 2004. – 544 с.

13.Практикум по биохимии сельскохозяйственных животных /

А.В.Чечеткин, В.И. Воронянский, Г.Г. Покусай, Н.И.Карташов, Н.Л.

Докторович, И.В.Кириченко. – М.: Высшая школа, 1980. – 303 с.

14. Яковлева, М.Н. Биохимия белков / М.Н. Яковлева, В.В. Осташкова. –

Петрозаводск: Петрозаводский государственный университет, 1990. – 31 с.

15. Филиппович, Ю. Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот: учеб.

пособие для пед. ин-тов / Ю. Б. Филиппович. - М.: Просвещение, 1978. - 192 с.:

ил.

16. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии: учеб. для вузов / Ю.Б.

Филиппович .- 4-е изд., перераб. и доп. - М. : Агар ; CПб. : Флинта : Лань, 1999. -

512 с. - ISBN 5-89218-046-8 .

119

Приложение А

(обязательное)

СанПиН 2.1.3.2630-10

Санитарно-эпидемиологические требования к организациям,

осуществляющим медицинскую деятельность

2. Требования к проведению дезинфекции, предстерилизационной очистки и стерилизации изделий медицинского назначения

2.1. Медицинские изделия многократного применения подлежат последовательно: дезинфекции, предстерилизационной очистке, стерилизации,

последующему хранению в условиях, исключающих вторичную контаминацию микроорганизмами.

2.2.Изделия однократного применения после использования при манипуляциях у пациентов подлежат обеззараживанию/обезвреживанию, их повторное использование запрещается.

2.3.При выборе дезинфекционных средств необходимо учитывать рекомендации изготовителей изделий медицинского назначения, касающиеся воздействия конкретных дезинфекционных средств на материалы этих изделий.

2.4.ООМД должны быть обеспечены медицинской техникой и изделиями медицинского назначения в количестве, достаточном для бесперебойной работы

сучетом времени, необходимого для их обработки между манипуляциями у пациентов.

2.5.Изделия медицинского назначения после применения подлежат дезинфекции независимо от дальнейшего их использования (изделия однократного и многократного применения). Дезинфекцию можно проводить физическими и химическими методами. Выбор метода зависит от особенностей изделия и его назначения.

120