Биохимия крови. Лабораторный практикум

1.8.3 Комплексонометрический метод определения общего кальция в сыворотке крови

Принцип метода.

Непосредственное титрование ионов кальция в сильно щелочной среде двунатриевой солью этилендиаминтетракусусной кислоты (ЭДТА) в

присутствии мурексида в качестве индикатора. Ионы кальция, соединенные с индикатором (розовый цвет), реагируют с помощью ЭДТА, выделяя индикатор,

вследствие чего последний окрашивает раствор в фиолетовый цвет.

Приборы.

Пипетка на 2 мл с делениями. Бюретка. Колбы конусные на 50 мл.

Реактивы.

Гидроксид натрия, 9 н. раствор. Индикатор мурексид (пурпурат аммония).

Используют только размельченную соль мурексида и нитрата калия в соотношении 1 : 800. ЭДТА, 0,01 н. раствор. (В мерной колбе на 1000 мл растворяют 1,861 г сухого вещества в 200 мл дистиллированной воды,

подщелачивая 10%-ным едким натром, пока раствор не станет вполне прозрачным, затем доводят до метки дистиллированной воды.) 1 мл 0,01 н.

раствора ЭДТА эквивалентен 0,2 мг кальция.

Ход работы.

Разбавляют 2 мл сыворотки крови в 48 мл дистиллированной воды,

добавляют 0,4 мл 9 н. раствора гидроксида натрия и шпателем немного мурексида. Титруют 0,01 н. раствором ЭДТА до тех пор, пока окраска смеси не станет фиолетовой. Параллельно титруют контрольную пробу, используя вместо сыворотки дистиллированную воду. Значение, полученное при титровании опытной пробы (А).

81

Расчет:

где х – содержание кальция, мг%; 0,2 - количество мг кальция, соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора ЭДТА;

a – количество мл 0,01 н. раствора ЭДТА, пошедшего на титрование опытной пробы;

b - контроля: 50-пересчет на мг %.

1.8 Лабораторная работа № 8. Определение протромбина

Протромбин (фактор II, тромбоген) — глюкопротеид, присутствующий в плазме крови и являющийся предшественником тромбина — фермента,

обусловливающего свертываемость крови. В нормальной плазме содержится

10—20 мг % протромбина. Биосинтез протромбина происходит в печени и

зависит от наличия витамина К. При недостатке этого витамина, возникающем,

например, при обтурационной желтухе, появляется самопроизвольная

кровоточивость, обусловленная нарушением синтеза протромбина. При

гипопротромбинемии может развиться ранняя детская геморрагия. Для определения содержания протромбина в плазме измеряют так называемое протромбиновое время. При снижении концентрации протромбина до 30—25 %

от нормы наблюдается резкое увеличение продолжительности кровотечения и возникновение спонтанной геморрагии. В этом случае больному назначают препараты витамина К.

Протромбин (фактор II, тромбоген) — неактивный предшественник

фермента тромбина, находящийся в плазме крови.

Протромбин является гликопротеидом, в нем имеется от 4,3 % до 9,6 %

углеводов (гексоз, пентоз, сиаловой кислоты,

82

гексозамина). Протромбин содержит 66,12 % углерода, 6,5 % водорода, 13,5 %

азота, 0,96 % серы и 3,75 % золы. Также в его составе обнаружено 18

аминокислот с преобладанием глютаминовой, аспарагиновой, аргинина, лизина.

Молекулярный вес протромбина равен 62700—68000. Электрофоретически протромбин не гомогенен, основная его часть соответствует α2-глобулинам.

Превращение протромбина в тромбин осуществляется при действии тканевого или кровяного тромбопластина в присутствии ионов кальция или при активации солями (25 % раствор цитрата натрия). Протромбин довольно устойчив и не разрушается при нагревании до 56 °С в течение 2 ч.

Во время свертывания крови почти весь протромбин превращается в тромбин. В нормальной плазме крови содержится от 10 до 20 мг % протромбина.

Его содержание меняется: оно повышено во время беременности и менструаций,

после кровопотерь, при гипервентиляции легких и снижено у новорожденных, а

также после приема пищи, при геморрагическом шоке, после приема салицилатов и сульфаниламидов, при заболеваниях печени.

Биосинтез протромбина осуществляется микросомами паренхиматозных клеток печени и зависит от наличия в организме витамина К. При недостаточности витамина К, вызванной нарушением его всасывания

(обтурационная желтуха, злокачественные образования), или при поражении паренхимы печени (цирроз, атрофия печени, декомпенсированные пороки сердца с застойными явлениями в печени) развивается острая гипопротромбинемия и вызванная ею кровоточивость. Непрямые антикоагулянты (дикумарин, фенилин и др.) подавляют синтез протромбина и вызывают через 12—24 ч после введения в организм снижение концентрации протромбина в крови.

83

1.8.1 Определение протромбина

Принцип метода.

В качестве источника протромбина берут сыворотку крови, из которой готовят ряд разведений. В качестве фибриногена используют свежую плазму крови, инактивированную нагреванием до 50-60 ºС в течение 30 минут. За единицу принимается минимальное количество протромбина, вызывающее свертывание белка.

Приборы.

Штатив с пробирками.

Ход работы.

Во все пробирки, кроме первой, наливают по 1 мл 1%-ного NaCl. В первую и вторую пробирки наливают по 1 мл неразведенной сыворотки (раствор протромбина). Содержимое второй пробирки хорошо перемешивают, втягивая жидкость в пипетку и выпуская ее обратно. 1 мл смеси из второй пробирки переносят в третью. Содержимое третьей пробирки перемешивают таким же образом и 1 мл смеси переносят в четвертую пробирку, и так вплоть до 10

пробирки, из которой 1 мл жидкости выбрасывают. Одиннадцатая пробирка содержит 1 мл NaCl (контроль).

Во все 11 пробирок добавляется по 2 мл плазмы, разведенной в 10 раз

(раствор фибрина). Штатив с пробирками ставят в холодильник на 24 ч.

Через 24 ч, осторожно наклоняя пробирки, определяют, где произошло свертывание. Количество тромбина вычисляется в той пробирке, где образовался еле заметный сгусток. В контрольной пробирке свертывания не должно произойти. Результаты исследований заносятся в таблицу 6.

84

Таблица 6 – Результаты исследований

Расчет:

Предположим, что свертывание произошло в первых восьми пробирках. В

девятой пробирке и дальше свертывания не произошло. В восьмой пробирке содержание сыворотки составляет 0,0078 мл:

0,0078 мл – 1 единица х = 1,0 / 0,0078 = 128 единиц. 1,0 мл – х

В норме 1 мл сыворотки крови содержит 62,5 – 250 единиц.

85

2 Биохимические методы исследования крови

2.1 Техника взятия крови

2.1.1 Забор крови из вены

Накануне исследования медицинская сестра предупреждает пациента,

чтобы то не завтракал, а ужинал не поздно и нетяжело. При этом следует объяснить, что кровь на анализ берется натощак, потому что таким образом получают наиболее достоверный результат.

Забор крови из вены производится утром, в процедурном кабинете либо у постели больного.

Медицинская сестра соответственно одевается, моет и дезинфицирует руки, надевает защитные очки, маску и перчатки. Далее — готовит:

1)лотки;

2)резиновый жгут;

3)стерильные ватные шарики или салфетки;

4)шприц объемом 10 или 20 мл либо вакуумные пробирки для забора крови на биохимические и серологиеские исследования.

Непосредственно алгоритм забора крови из вены состоит из последовательных действий:

1) все данные пациента регистрируются в журнале или компьютере.

Емкости для взятия крови и направления маркируются;

2)пациент укладывается либо усаживается в удобном положении с разогнутым локтевым суставом, внутренней поверхностью вверх;

3)под локтевой сустав подкладывается валик или специальная подушка;

4)резиновый жгут накладывается на среднюю треть плеча поверх тканевой салфетки так, чтобы получить венозный застой;

5)пациента просят несколько раз сжать кулак и разжать, повторяя движения до достаточного наполнения вен кровью. Кулак фиксируется в зажатом положении;

86

6) кожа пациента обрабатывается ватным шариком либо стерильной салфеткой с 70%-ным спиртом, как при внутривенной инъекции, дважды:

сначала большая площадь кожи, затем — меньшая, где будет производиться прокол;

7)шарики сбрасываются в лоток и производится пунция вены. Если используется шприц, поршень должен располагаться максимально близко к краю цилиндра с канюлей иглы, чтобы в цилиндре не было воздуха;

8)вена пунктируется под острым углом к коже до ощущения попадания в пустоту. Поршень шприца постепенно оттягивается, при этом цилиндр наполняется кровью. Сразу после попадания иглы в вену жгут снимается с плеча пациента. Все время забора крови медсестра следит за состоянием и самочувствием пациента;

9)при использовании вакуумной пробирки вена пунктируется иглой с переходником, к которому после попадания в вену присоединяется пробирка.

При заборе крови и на биохимическое, и на серологическое исследование

наполненная пробирка отсоединяется, а пустая — присоединяется к игле через

тот же переходник;

10)после набора нужного количества крови в шприц игла извлекается из вены после прижатия к месту прокола ватного шарика со спиртом. Если используются вакуум-системы, игла извлекается только после отсоединения пробирки;

11)пациента просят прижать ватный шарик и удерживать его на локтевом сгибе в течение 5 минут;

12)промаркированные пробирки помещают в специальный контейнер для транспортировки в лабораторию;

13)весь инструментарий и использованные расходные материалы дезинфицируются.

87

2.1.2 Забор крови из пальца

Кровь для планового анализа следует брать утром натощак или через 1 час после легкого завтрака.

Не рекомендуется брать кровь сразу после физической или умственной нагрузки, парентерального введения медикаментов, физиотерапевтических процедур, рентгенологического исследования и т.д. Так, нервное напряжение,

эмоциональные перегрузки ведут к развитию кратковременного нейтрофильного лейкоцитоза без существенного омоложения состава лейкоцитов. Несколько повышает уровень лейкоцитов в крови прием пищи. Аналогичный эффект вызывается введением адреналина. В основе этой реакции лежит преимущественно мобилизация сосудистого гранулоцитарного резерва. При этом лейкоцитоз в течение нескольких десятков минут. Медиаторы

(норадреналин, ацетилхолин) влияют на кроветворную систему, не только вызывая перераспределение крови, но и путем прямого воздействия на стволовые клетки, в которых имеются адрено- и холинорецепторы. Лейкоцитоз с палочкоядерным сдвигом вызывается введением пирогенола и глюкокортикоидных стероидных гормонов, достигая максимума через 2-6 часов и обусловлен выходом гранулоцитов из костномозгового резерва. Содержание гранулоцитов в костномозговом резерве превышает их количество в кровеносном русле в 30-50 раз. Такие гормоны как андрогены, стимулируют эритропоэз, мобилизируя эндогенный эритропоэтин. Повторные исследования следует проводить в одни и те же часы, поскольку морфологический состав крови подвержен колебаниям на протяжении суток.

Кожу на месте укола протирают ватным тампоном, смоченным сначала

70%-ным спиртом, затем эфиром. Укол лучше производить сбоку, где более густая капиллярная сеть, на глубину от 2 до 3 мм в зависимости от толщины кожи. Кровь из ранки должна вытекать свободно, так как при сильном

88

надавливании на палец возможно перемешивание тканевой жидкости, что приводит к искажению результата.

Затем сухим тампоном удаляется первая капля крови.

Не прикасаясь к раневой поверхности, с помощью переходника и

резиновой груши наполнить кровью капилляр до метки.

Новым стерильным тампоном, смоченным 70%-ным спиртом, обработать

раневую поверхность пальца.

Перед каждым забором крови лаборант моет руки под проточной водой с мылом или обрабатывает их стерильным тампоном, смоченным 70%-ным

спиртом.

При манипуляциях, лабораторных исследованиях с возможным попаданием на медицинского работника крови или других биологических жидкостей используются средства индивидуальной защиты: обязательны халат

хирургического типа, резиновые перчатки, очки, маска (или щиток).

Любое повреждение кожи, слизистых, забрызгивание их кровью или другой биологической жидкостью пациента при оказании им медицинской помощи должно квалифицироваться как возможный контакт с материалом,

содержащим ВИЧ или другой агент инфекционного заболевания.

Если контакт с кровью или другой биологической жидкостью произошел с нарушением целостности кожных покровов (укол, порез), пострадавший должен:

1)быстро снять перчатки рабочей поверхностью внутрь;

2)сразу же выдавить из раны кровь;

3)поврежденное место обеззаразить одним из дезинфицирующих растворов (70%-ный спирт, 5 % настойка йода при порезах, 3 % раствор перекиси водорода при уколах и др.);

4)руки вымыть под проточной водой с мылом и затем протереть спиртом;

5)на рану наложить пластырь, надеть напальчник;

6)при необходимости продолжить работу надеть новые перчатки;

89

В случае загрязнения кровью или другой биологической жидкостью без

повреждения кожи:

1)обработать кожу спиртом, а при его отсутствии 3% раствором перекиси водорода, 3% раствором хлорамина или другими дез.растворами;

2)промыть место загрязнения водой с мылом и повторно обработать

спиртом.

При попадании биологического материала на слизистые оболочки:

1)полости рта: прополоскать 70%-ным спиртом;

2)полости носа: закапать 30 % раствор альбуцида из тюбика-капельницы;

3)глаза: промыть водой (чистыми руками), закапать несколько капель

30 % раствора альбуцида из тюбика-капельницы.

При отсутствии 30 % раствора альбуцида для обработки слизистых оболочек носа и глаз можно использовать 0,05 % раствор марганцевокислого калия.

При попадании биологического материала на халат, одежду: это место немедленно обработать одним из дезинфицирующих растворов.

При промокании одежды и/или ее массивном загрязнении:

1)обеззараживаются перчатки;

2)далее одежда снимается и замачивается одном из дезинфицирующих растворов (кроме 6 % перекиси водорода, нейтрального гипохлорита кальция,

которые разрушают ткани) или помещается в полиэтиленовый пакет для автоклавирования;

3) кожа рук и других участков тела под местом загрязнения одежды протирается 70%-ным спиртом, затем следует промыть водой с мылом и повторно протереть спиртом.

90