Биохимия крови. Лабораторный практикум

Реактивы.

Соляная кислота, концентрированная. Марганцевокислый калий, 2%-ный раствор. Хлороформ.

Ход работы.

К 2 мл мочи приливают такое же количество соляной кислоты, 2 капли

2%-ного KMnO4 и 2 мл хлороформа. Пробирку плотно закрывают пробкой и несколько раз переворачивают, извлекая индиго хлороформом. При наличии индикана хлороформ окрашивается в синий цвет, интенсивность которого зависит от количества индикана.

1.5 Лабораторная работа № 5. Реакции на обнаружение билирубина

Различают два типа билирубина, циркулирующего в крови и дающего различные реакции. Первый из них дает сразу розовую окраску от прибавления диазореактива, в то время как второй дает окраску только после предварительного осаждения белков сыворотки крови путем прибавления алкоголя.

Первый тип реакций носит название прямой реакции, и билирубин также называют прямым, второй тип называется непрямой реакцией, и билирубин потому носит название непрямого.

51

Непрямой билирубин.

Увеличение процентного содержания непрямого билирубина в сыворотке может быть вызвано с одной стороны гиперпродукцией его ретикулоэндотелиальной системой, что бывает, например, при усиленном гемолизе эритроцитов вследствие их неполноценности. С другой стороны,

причина появления увеличенного содержания непрямого билирубина может заключаться в нарушении выделительных свойств печеночных клеток, как это бывает, например, при сердечной недостаточности.

Такая желтуха, сопровождающаяся наличием в сыворотке увеличенного содержания непрямого билирубина, называется динамической или чаще гемолитической желтухой. При этой желтухе, несмотря на повышение содержание билирубина в сыворотке, желчные пигменты в моче (билирубин)

отсутствуют, так как они не проходят в мочу через почечный фильтр.

Каловые массы при этой форме желтухи хорошо окрашены, ибо в двенадцатиперстную кишку из печени поступает желчь, содержащая больше,

чем в норме билирубина и по той же причине с мочой выделяется уробилин в больше нормы количестве.

Вторым, сравнительно нередко встречающимся заболеванием, при котором в крови повышено содержание непрямого билирубина, является аддисон-

бирмеровское малокровие. Только степень билирубинемии при ней обычно не достигает высоких цифр. То же наблюдается при пароксизмальной гемоглобинурии, рассасывании больших гематом, геморрагических экссудатов,

малярии, застойной печени и т. д. Тот же характер непрямой билирубинемии имеет желтуха новорожденных, а также при отравлениях мышьяком и другими гемолитическими ядами.

Прямой билирубин.

Значительно чаще приходится сталкиваться с повышением содержанием в сыворотке крови прямого билирубина, указывающего либо на поражение печеночной клетки, либо на препятствие к оттоку желчи по желчным ходам.

52

Определение содержания количества билирубина в крови имеет большой смысл для выявления так называемых латентных (скрытых желтух), т. е. таких состояний, при которых количество билирубина в крови превышает нормальный его уровень, но желтушной окраски склер и кожных покровов еще нет. При этом количество прямого билирубина еще не превышает 2 мг % или 4 единиц Гийманс-ван-ден-Берга. Содержание билирубина в крови свыше 2 мг % обычно распознается уже при осмотре по желтушной окраске покровов.

Вэтом отношении количественное определение билирубина имеет известное диагностическое значение в случаях не совсем ясных приступов желчнокаменной болезни для отличия их от болей при язве двенадцатиперстной кишки, печеночно-каменной болезни и других сходных заболеваниях.

Вслучаях желчнокаменной колики сыворотка крови, взятая лучше всего на высоте приступа или сразу после него, обнаруживает часто умеренно выраженную билирубинемию. Это обстоятельство, несомненно, свидетельствует

опеченочной колике.

Однако отсутствие билирубинемии после болевого синдрома еще не должно расцениваться как симптом, говорящий против желчнокаменной болезни. Имеет большое значение также и динамическое определение содержания билирубина на протяжении заболевания при явно выраженной желтухе покровов и слизистых оболочек, как способ объективного контроля над ходом процесса.

Увеличение содержания билирубина, нарастание билирубинемии в этих случаях свидетельствует о прогрессе процесса, в то время как уменьшение говорит об улучшении.

Увеличение содержания прямого билирубина в крови наблюдается при желчнокаменной болезни, в особенности, если камень закупоривает общий желчный проток, при гепатите (болезнь Боткина), некоторых опухолях печени и желчного пузыря, нарушающих отток желчи по желчным путям, циррозах печени, токсикозах беременных, протекающих с явлениями желтухи,

сифилитическом гепатите, острой и подострой желтой атрофии печени,

53

септических ангиохолитах и других поражениях желчных путей. Прямая гипербилирубинемия наблюдается также при сальварсанной желтухе,

отравлениях хлороформом, фосфором, а также при ряде септических заболеваний, эндокардите, истинном ревматизме. Заслуживает внимания то обстоятельство, что билирубинемия при болезни Боткина протекает с наличием в моче билирубина (т.е. желчных пигментов), так как этот вид билирубина проходит почечный фильтр и попадает в мочу. Зато в моче на высоте болезни отмечается отсутствие уробилина.

Вкрови могут наблюдаться и оба вида билирубина.

Втаких случаях реакция протекает двухфазно – вначале: прямая, затем после прибавления алкоголя она значительно усиливается вследствие присоединения к ней непрямого билирубина. Подобная реакция наблюдается иногда при гипертрофическом циррозе печени.

Билирубин – вещество, образующееся в организме при распаде гемоглобина. Состарившиеся эритроциты разрушаются в селезенке, при этом образуется непрямой (несвязанный) билирубин. Он нерастворим в воде (не может выводиться почками) и потому для переноса в кровяном русле связывается с альбумином – низкомолекулярным белком плазмы крови.

Непрямой билирубин является тканевым ядом, более всего он опасен для центральной нервной системы, в частности, головного мозга. Затем непрямой билирубин достигает печени, где связывается с остатком глюкуроновой кислоты и превращается в прямой (связанный) билирубин. В этом состоянии он нетоксичен для клеток и тканей организма, растворим в воде и может выделяться почками.

Билирубин выделяется с желчью и поступает в кишечник. В тех случаях,

когда скорость распада эритроцитов опережает связывающую способность печени, непрямой билирубин начинает накапливаться в кровяном русле и вызывает окрашивание кожи, слизистых оболочек и склер глаз в желтый цвет.

54

1.5.1 Реакции на обнаружение билирубина

Принцип метода.

Эритроциты млекопитающих функционируют до 90-110 дней, а затем разрушаются в клетках ретикуло-эндотелиальной системы. Освободившийся гемоглобин расщепляется на белок и гем. Гем теряет железо и подвергается дальнейшим превращениям в организме. При этом образуется ряд веществ,

молекулы которых представляют собой открытые цепи. Наименее восстановленным из них является пигмент желчи биливердин, который,

восстанавливаясь, переходит в билирубин.

Билирубин образуется в селезенке, печени, а также, по-видимому, в

эритроцитах. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах от 0,2 до 0,8 мг %. При различных поражениях печени и желтухе часто наблюдается гипербилирубинемия, когда концентрация в крови достигает от 30

до 35 мг %. В сыворотке имеется два билирубина: свободный, нерастворимы в воде, и билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, хорошо растворимый в воде. Оба вида билирубина связаны с альбуминами. Свободный билирубин дает розовое окрашивание с диазореактивом только после обработки сыворотки этиловым или метиловым спиртом. Эта реакция на билирубин называется непрямой. Связанный с глюкуроновой кислотой билирубин дает прямую диазореакцию.

Приборы.

Бюретки. Штатив с пробирками. Воронки. Фильтры бумажные. Пипетки на

1 и 2 мл. Часовое стекло. Стеклянные палочки.

Реактивы.

Диазореактив, приготавливается смешиванием двух растворов: нитрита натрия, 0,5%-ного раствора, и сульфаниловой кислоты, 0,1%-ного раствора.

Спирт этиловый. Сыворотка крови. Свежая желчь.

55

Ход работы.

Непрямая реакция. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки и 2 мл этилового спирта, фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно – розовое окрашивание.

Прямая реакция. На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю желчи, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива, перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина красное окрашивание.

1.5.2 Реакции на желчные пигменты

Желчные пигменты обнаруживаются в моче при различных поражениях печени, протекающих с симптомами желтухи. При механической и паренхиматозной желтухах в моче обнаруживается большое количество билирубина и уробилина, а при гемолитической – уробилина.

1.5.2.1 Проба Гмелина

Ход работы.

В пробирку наливают 2 мл концентрированной азотной кислоты с примесью азотистой (последняя обычно содержится в азотной кислоте,

постоянной на свету). Осторожно по стенке наслаивают от 1 до 2 мл мочи. При наличии желчных пигментов на границе двух жидкостей появляются кольца,

имеющие различную окраску: зеленую, синюю, фиолетовую, красную и желтую.

56

1.5.2.2 Проба Розенбаха

Ход работы.

2-3 мл исследуемой мочи фильтруют через небольшой бумажный фильтр,

на котором задерживается часть желчных пигментов: фильтр разворачивают,

кладут на стекло, в центр его наносят каплю концентрированной азотной кислоты. Присутствие желчных пигментов сопровождается появлением различно окрашенных колец. Зеленое кольцо располагается по периферии, а

ближе к центру будут синее, фиолетовое, красное и желтое.

1.6 Лабораторная работа № 6. Определение холестерола в сыворотке

крови

Холестерин или холестерол – органическое соединение, важнейший компонент жирового обмена (рисунок 6). Холестерол содержится во всех клетках животного организма в свободном состоянии и в виде эфиров с высшими жирными кислотами – холестериды.

Рисунок 6 - Холестерол

Особенно много холестерола в нервной ткани, желчи, сперме, кожном сале. Лучший материал для получения холестерола – желчные камни, состоящие

57

иногда на 90 % из холестерола. Близки по своему строению к холестеролу желчные кислоты, половые гормоны и витамины группы D.

Роль холестерина в организме:

1)холестерин используется для построения мембран клеток;

2)в печени холестерин – предшественник желчи;

3)холестерол участвует в синтезе половых гормонов, в синтезе витамина

D.

Холестерин в крови содержится в следующих формах:

1)общий холестерин;

2)холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП);

3)холестерин липопротеидов высокой плотности (ЛПВП).

Холестерин липопротеинов низкой плотности (холестерин ЛПНП) – это основная транспортная форма общего холестерина. Холестерин ЛПНП переносит общий холестерин в ткани и органы. Определение холестерина ЛПНП проводят для того, чтобы выявить повышение холестерина в крови. При развитии сосудистых заболеваний именно холестерин ЛПНП – источник накопления холестерина в стенках сосудов. Риск развития атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС) более тесно связан с холестерином ЛПНП,

чем с общим холестерином.

Холестерин липопротеинов высокой плотности (холестерин ЛПВП) осуществляет транспорт жиров, включая общий холестерин от одной группы клеток к другой, где холестерин ЛПВП сохраняется или распадается.

Холестерин ЛПВП переносит холестерин из сосудов сердца, сердечной мышцы,

артерий мозга и других периферических органов в печень, где из холестерина образуется желчь. Холестерин ЛПВП удаляет излишки холестерина из клеток организма.

Организм человека самостоятельно вырабатывает холестерол. Синтез холестерина происходит в печени (от 50 % до 80 %), некоторое количество холестерола вырабатывается в коже, надпочечниках и стенках кишечника. Часть холестерина поступает в организм с продуктами питания. Холестерин

58

содержится в жирном мясе, рыбе, сливочном масле, яйцах, молоке и других

4,82 ммоль/л, для женщин норма холестирина - от 1,92 до 4,51 ммоль/л.

Нормы уровня холестерина ЛПВП для мужчин - от 0,7 до 1,73 ммоль/л, для женщин уровень холестерина крови в норме – от 0,862 до 28 ммоль/л.

Определение холестерина крови – обязательный этап диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы (ишемическая болезнь сердца,

инфаркт миокарда), атеросклероза и заболеваний печени.

Состояние организма, при котором отмечается повышенный уровень холестерина и триглицеридов в крови врачи называют гиперлипидемией.

Повышенный холестерин или гиперхолестеринемия приводит к образованию атеросклеротических бляшек: холестерин присоединяется к стенкам сосудов, сужая просвет внутри них. На холестериновых бляшках образуются тромбы, которые могут оторваться и попасть в кровеносное русло,

вызвав закупорку сосудов в различных органах и тканях, что может привести к атеросклерозу, инфаркту миокарда и другим заболеваниям.

Анализ холестерина покажет повышенное содержание холестерина в крови, что характерно для людей, в чьем рационе преобладает пища, богатая углеводами и насыщенными жирами. Уровень холестерина снизить возможно,

изменив рацион пищи. Во-первых, необходимо употреблять в пищу меньше продуктов, в которых содержится холестерин: ограничить употребление сладостей, яиц, масла, заменить жирное молоко на обезжиренное. Во-вторых,

необходимо заменить насыщенные жирные кислоты на ненасыщенные.

Ненасыщенные жирные кислоты содержат растительные масла и рыбий жир.

59

Снижение холестерина своими силами не имеет результата в тех случаях,

когда повышенный холестерин (общий холестерин, ЛПВП, ЛПНП) или гиперхолестеринемия – симптом следующих заболеваний:

1)ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда (уровень холестерина выше 6,22 ммоль/л);

2)атеросклероз;

3)заболевания печени (первичный цирроз, внепеченочные желтухи);

4)заболевания почек (гломерулонефрит, хроническая почечная недостаточность, нефротический синдром);

5)хронический панкреатит, рак поджелудочной железы;

6)сахарный диабет;

7)гипотиреоз;

8)Ожирение;

9)дефицит соматотропного гормона (СТГ);

10)подагра;

11)алкоголизм.

Повышение холестерина ЛПВП происходит при нервной анорексии.

Высокий холестерин крови может быть следствием приема половых гормонов или контрацептивов. Обычно при беременности холестерин повышенный.

Высокий холестерол крови наблюдается у людей, подверженных стрессам,

курению и злоупотреблению алкоголем.

Понижение холестерина не менее опасно для здоровья человека. Тест холестерина может показать снижение уровня холестерина (общего холестерина,

ЛПВП, ЛПНП) при нарушении усвоения жиров, голодании, обширных ожогах.

Снижение холестерина может быть симптомом следующих заболеваний:

1)гипертиреоз;

2)хроническая сердечная недостаточность;

3)мегалобластическая анемия;

4)талассемия;

5)миеломная болезнь;

60