Биохимия крови. Лабораторный практикум

уксусная кислота, дистиллированная вода (4:1:5); смесь II: н-бутиловый спирт,

ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода (40:15:5). Раствор 8-

оксихинолина для освобождения хроматографической бумаги от катионов металлов. Раствор нингидрина (готовят перед работой путем смешивания 95

частей нингидрина 0,5%-ного раствора в ацетоне с 1 частью ледяной уксусной кислоты и 4 частями дистиллированной воды). Сульфат меди, насыщенный раствор, в 75%-ном этиловом спирте. Набор аминокислот.

Ход работы:

1) получение концентрированного безбелкового экстракта сыворотки крови. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 1 мл солянокислого ацетона. Спустя

30 мин осадок белков удаляют центрифугированием, промывают его дважды

0,5 мл солянокислого ацетона. Собранные фугаты упаривают досуха на водяной бане при 40°С в стеклянных микрочашках, используя плавающий штатив. Сухой остаток растворяют в 0,3 мл дистиллированной воды и обрабатывают 0,3 мл эфира для удаления липидов. После удаления эфира слой сгущают досуха на водяной бане при 40°С. Сухой остаток растворяют в 0,05 - 0,10 мл дистиллированной воды;

2) получение одномерных хроматограмм сыворотки крови. 0,02 мл полученного экстракта наносят на бумагу размером 2 x 27 см с помощью автоматической микропипетки порциями по 0,005 мл. Хроматографирование проводят восходящим методом 2-3 раза в одном направлении сначала в смеси I,

затем в смеси II. Время прохождения растворителя в одном направлении 7 ч.

Высушенную хроматограмму проявляют раствором нингидрина в ацетоне; 3) количественное определение свободных аминокислот сыворотки крови.

Фиолетовые пятна аминокислот вырезают, разрезают на мелкие кусочки и помещают в микропробирки, содержащие 0,25 мл раствора сульфата меди в

75%-ном этиловом спирте. Фиолетовая окраска аминокислот переходит в оранжево - красную в результате образования медного производного аминокислот с нингидрином. Экстракцию продолжают в течение 1 ч при комнатной температуре. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе при зеленом

31

светофильтре в кювете с толщиной слоя 5 мм относительно контрольной пробы на бумагу. Расчеты по содержанию аминокислот проводят по калибровочным графикам, полученным со стандартными растворами аминокислот;

4) построение стандартной кривой. Готовят растворы аминокислот: 0,01;

0,005 и 0,0025 М. На бумагу наносят 0,002 мл 0,01 М, 0,002 мл 0,005 М и

0,002 мл 0,0025 М растворов аминокислот. Каждая точка графика будет соответствовать 0,02, 0,01 и 0,005 мкМ аминокислоты. Разделение смеси стандартных аминокислот проводят при соблюдении всех условий хроматографирования.

Расчеты проводят по формуле:

где x – количество аминокислоты в 1 мл, мкМ;

a – количество аминокислоты, найденное по графику, мкМ;

c – общее количество экстракта, мл, соответствующее 0,2 мл сыворотки; b – количество экстракта, взятое для хроматографирования, мл.

Эта методика позволяет определить в сыворотке 9 аминокислот.

1.4.2 Разделение аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге

Метод основан на различной растворимости аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: воде и органическом растворителе. Водяная фаза неподвижна, так как вода сорбирована на инертном носителе - целлюлозе,

которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере)

удерживает до 20-22 % воды. Подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислот в воде и

32

меньше в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота на бумаге.

Положение аминокислот на бумаге можно определить с помощью нингидриновой реакции: в присутствии нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде окрашенных пятен.

Показателем скорости движения аминокислоты является коэффициент распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстояния (в миллиметрах) от места нанесения аминокислоты (точка старта) до середины ее пятна (а) к расстоянию от точки старта до фронта растворителя (в):

Коэффициент распределения является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель,

температура, сорт бумаги и др.).

Существуют различные способы хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге.

1.4.2.1 Радиальная (круговая) хроматография

Для разделения смеси аминокислот используется растворитель, состоящий из смеси н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5.

Приготовленная смесь встряхивается в делительной воронке в течение 5 минут,

а затем отстаивается 7-10 часов, после чего нижний слой используется для насыщения хроматографической камеры парами, а верхний - для разделения аминокислот. Хроматографической камерой служит эксикатор.

Ход работы:

1) хроматографическую бумагу вырезают в форме диска, диаметр которого соответствует внутренним размерам диаметра эксикатора. В центр диска (на

33

точку старта) наносят микропипеткой в несколько приемов от 0,005 до 0,01 мл исследуемой смеси аминокислот. Нанесение смеси следует проводить очень аккуратно, слегка касаясь микропипеткой стартовой точки, чтобы диаметр мокрого пятна был не более 5 мм. После каждого нанесения пятно подсушивают над электроплиткой или в термостате;

2)в центре хроматограмм делают иглой отверстие, в которое пропускают фитилек из сложенной вчетверо нити. Хроматограмму помещают в эксикатор, на дно которого предварительно наливают верхний слой растворителя. Проверяют положение фитилька и хроматограммы: конец фитилька должен быть погружен в растворитель, а края хроматограммы должны находиться на выступах эксикатора. Закрывают эксикатор крышкой;

3)растворитель поднимается вверх по фитильку, а затем радиально распространяется по бумаге от центра. Когда растворитель достигнет края бумаги, ее вынимают из эксикатора, высушивают под тягой, обрабатывают 0,5 %

раствором нингидрина (готовится на ацетоне или спирте) и помещают в сушильный шкаф при температуре от 60 до 70 оС на 10-15 минут. На хроматограмме появляются сине-фиолетовые пятна, каждое из которых соответствует отдельной аминокислоте.

1.4.2.2 Нисходящая хроматография

В качестве хроматографической камеры используют высокие стеклянные банки с выступом в верхней части. На выступ в строго горизонтальном положении ставят лодочку - специальный стеклянный сосуд для растворителя.

Ход работы:

1) из хроматографической бумаги вырезают полоску шириной 5 см и длиной, примерно соответствующей высоте камеры. На расстоянии 10 см от конца полоски проводят простым карандашом стартовую линию, в середине которой отмечают точку старта. На стартовую точку микропипеткой наносят от

34

0,005 до 0,01 мл смеси аминокислот (в несколько приемов, диаметр мокрого пятна не более 5 мм), периодически просушивая бумагу над электрической плиткой (или над настольной лампой);

2)на дно хроматографической камеры наливают небольшое количество нижнего слоя растворителя, а в установленную лодочку - верхний слой растворителя. Хроматограмму с нанесенной смесью аминокислот помещают в камеру так, чтобы ближний к старту конец был опущен в лодочку и зафиксирован в ней предметным стеклом, а другой висел вертикально, не касаясь стенок камеры. Камеру закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов;

3)растворитель продвигается по хроматограмме сверху вниз, и когда фронт его приблизится к нижнему краю бумаги, хроматограмму вынимают из камеры и высушивают под тягой. Затем ее обрабатывают 0,5 % раствором нингидрина и помещают в сушильный шкаф при 60 – 70 оС на 10 - 15 минут для развития окраски, после чего на ней появляются пятна сине-фиолетового или лилового цвета, соответствующие аминокислотам.

Оформление работы:

1)зарисовать хроматограммы и хроматографические камеры;

2)рассчитать коэффициенты распределения аминокислот, разделенных методами радиальной и нисходящей хроматографии на бумаге.

Техника безопасности:

1)осторожно обращайтесь с растворителем, содержащим бутиловый спирт

иледяную уксусную кислоту. Растворитель обладает резким неприятным запахом, пары его могут вызвать ожоги слизистых;

2)соблюдайте правила пожарной безопасности при пользовании электрической плиткой и сушильным шкафом.

35

1.4.3 Количественное определение аммиака

Аммиак – продукт дезаминирования аминокислот и нуклеотидов. Он высоко токсичен для организма, поэтому большая часть аммиака в ходе орнитинового цикла конвертируется печенью в более безвредное и менее токсичное соединение — карбамид (мочевину). Мочевина затем выводится почками, причѐм часть мочевины может быть конвертирована печенью или почками обратно в аммиак.

Аммиак может также использоваться печенью для обратного процесса — ресинтеза аминокислот из аммиака и кетоаналогов аминокислот. Этот процесс носит название «восстановительное аминирование». Таким образом из щавелевоуксусной кислоты получается аспарагиновая, из α-кетоглутаровой — глутаминовая и т. д.

Его содержание в моче зависит главным образом от характера пищи и функционального состояния печени. Аммиак ядовит. В организме он обезвреживается в печени и других тканях.

Принцип метода.

При взаимодействии аммонийных солей с формальдегидом образуется соляная кислота, которая в последующем оттитровывается щелочью.

Химизм реакций.

В нейтральной среде аммонийные соли распадаются с образованием гексаметилентетрамина (уротропин) и соляной кислоты:

Приборы.

Колба коническая емкостью 100 мл. Пипетки на 5 мл с делениями.

Бюретка. Капельница.

36

Реактивы.

Гидроксид натрия, 0,1 н. раствор. Фенолфталеин, 1%-ный раствор.

Формольная смесь (готовится перед употреблением). К 50 мл формалина прибавляют 1 мл 0,05%-ного водно-спиртового (1:1) раствора фенолфталеина и затем 0,2 н. гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания.

Ход работы.

5 мл свежей мочи наливают в колбу, туда же вносят 1-2 капли фенолфталеина и добавляют 0,1 н. раствор щелочи, доводя содержимое колбы до слабощелочной реакции по фенолфталеину (слабо-розовая окраска). Затем в колбу добавляют 2,5 мл формольной смеси и титруют 0,1 н. едким натром до слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин. Учитывается количество щелочи, пошедшей на титрование.

Расчет.

1 мл 0,1н. раствора щелочи эквивалентен 1,7 мг аммиака. Умножая количество миллилитров щелочи, использованной на титрование после добавления формольной смеси, на 1,7, получают содержание аммиака в 5 мл мочи, которое было взято для исследования.

Пример расчета. На титрование 5 мл мочи пошло 1,5 мл 0,1 н. раствора щелочи. Тогда

х=(1,5*1,7*100) / 5 = 51,0 мг % аммиака.

1.4.4 Электрофорез белков сыворотки крови

В плазме крови содержится 7 % всех белков организма при концентрации от 60 до 80 г/л. Белки плазмы крови выполняют множество функций. Одна из них заключается в поддержании осмотического давления, так как белки связывают воду и удерживают еѐ в кровеносном русле.

37

Основные функции белков плазмы крови:

1)образуют важнейшую буферную систему крови и поддерживают рН крови в пределах от 7,37 до 7,43;

2)белки плазмы определяют вязкость крови и, следовательно, играют важную роль в гемодинамике кровеносной системы;

3)белки плазмы крови являются резервом аминокислот для организма;

4)иммуноглобулины, белки свѐртывающей системы крови, α1-антитрипсин

ибелки системы комплемента осуществляют защитную функцию.

Содержание и функции некоторых белков плазмы крови человека приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Содержание и функции некоторых белков плазмы крови человека

38

Продолжение таблицы 5

39

Продолжение таблицы 5

Методом электрофореза на ацетилцеллюлозе или геле агарозы белки плазмы крови можно разделить на альбумины (от 55 % до 65 %), α1-глобулины

(от 2 % до 4 %), α2 -глобулины (от 6 % до 12 %), β-глобулины (от 8 % до 12 %) и γ-глобулины (от 12 % до 22 %) (рисунок 4).

Применение других сред для электрофоретического разделения белков позволяет обнаружить большее количество фракций. Например, при

40