Биохимия крови. Лабораторный практикум

Таблица 1 - pH крови у различных животных

Относительное постоянство pH крови обеспечивается буферами:

гемоглобином, белками, аминокислотами плазмы крови, бикарбонатным буфером H2CO3/NaHCO3; фосфатным KH2PO4/K2HPO4 и др.

Буферная емкость плазмы зависит главным образом от наличия бикарбоната, способного связывать то или иное количество угольной кислоты.

Вот почему практически очень важно определять щелочной резерв крови, от которого зависит постоянство pH последней.

Резервная щелочность плазмы крови определяется различными методами.

За последнее время широкое распространение получил метод Еременко с использованием чашек Конвея.

Принцип метода.

Определение щелочных резервов крови. Один из способов нейтрализации образующихся в организме кислот заключается в том, что эти кислоты вытесняют более слабую – СО2 и соединяются с теми основаниями, с которыми была соединена углекислота. Последняя в соответствующих количествах выделяется из организма и, таким образом, реакция крови не изменяется.

Приборы.

Чашка Конвея. Пипетки на 1 и 2 мл. Микробюретка.

11

Реактивы.

Серная кислота, 0,01 н. раствор. Гидроксид натрия, 0,02%-ный раствор.

Фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор. Серная кислота, 10% - ный раствор.

Технику взятия и приготовления плазмы см. выше.

Ход работы.

В наружную борозду чашки Конвея вводят 0,5 мл исследуемой плазмы крови. В центральное углубление наливают (точно) 2 мл 0,01 н. раствор гидроксида натрия. Затем в наружную бороздку наливают (так, чтобы вылитая жидкость не соприкасалась с плазмой крови) 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты. После этого чашку закрывают стеклом, которое плотно притирают. Для обеспечения герметизации осторожными колебаниями чашки плазму крови в наружной борозде смешивают с серной кислотой. Чашку оставляют стоять 1 ч (лучше сутки, если позволяет время). В течение этого срока полностью выделяется СО2 и поглощается раствором щелочи, который имеется в центральном углублении чашки Конвея.

Через 1 час (или сутки) чашку Конвея открывают, среднее углубление – непосредственно в раствор щелочи – опускают каплю фенолфталеина и содержимое титруют с помощью 0,01 н. раствора серной кислоты.

Параллельно ставят контрольный опыт, который проводится аналогичным образом с той лишь разницей, что вместо плазмы берут 0,5 мл дистиллированной воды.

Расчет:

где x – количество СО2 в 100 мл крови;

a – количество 0,01 н. серной кислоты, которое пошло на титрование

(опыт);

b – количество 0,01 н. раствора серной кислоты, пошедшей на титрование

(контроль);

12

0,224 – фактор пересчета 0,01 н. раствора гидроксида натрия на СО2; 200 – чтобы перевести взятые для опыта 0,5 мл сыворотки крови на 100 мл.

Например, если в нашем опыте на титрование опытной пробы пошло

1,60 мл 0,01 н. раствора серной кислоты и на контроль – 0,40 мл, а количество взятой крови было равно 0,5 мл, то в этом случае содержание СО2 в 100 мл плазмы составит:

x = (1,60 – 0,40) * 0,0224 * 200 = 53,76 об. % СО2

Давление и температура при такой постановке опыта не учитывается.

Ниже приводится величина резервной щелочности крови различных животных (таблица 2).

Таблица 2 – Величина резервной щелочности крови у различных животных

1.2.4 Качественное определение хлоридов

При добавлении азотнокислого серебра к моче, подкисленной азотной кислотой, выпадает белый осадок хлористого серебра, темнеющий на свету,

нерастворимый в азотной кислоте, но растворимый в аммиаке:

1)NaCl + AgNO3 → AgCl + NaNO3

2)AgCl +NH4OH → Ag(NH3)Cl + H2O

13

Приборы.

Штатив с пробирками. Капельница.

Реактивы.

Азотнокислое серебро. Азотная кислота, 10%-ный раствор.

Ход работы.

К 20 каплям мочи приливают 2-5 капель 1%-ного раствора азотнокислого серебра и 2 капли 10%-ного раствора азотной кислоты. Выпадает белый творожистый осадок хлористого серебра (подкисление азотной кислотой предотвращает образование растворимого в азотной кислоте фосфорнокислого серебра).

1.2.5 Определение сульфатов

Принцип определения сульфатов основан на том, что при подкислении мочи и добавлении хлористого бария образуется белый осадок сернокислого бария, нерастворимый в кислотах и щелочах:

Na2SO4 + BaCl2 → BaSO4 + 2NaCl

Нейтральная сера реагирует с хлористым барием только после окисления в сульфаты.

Приборы.

Водяная баня. Колбочки. Фильтры.

Реактивы.

Соляная кислота, 10%-ный раствор. Хлористый барий, 5%-ный раствор.

Ход работы:

1) к 20 каплям мочи приливают 5 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и по каплям 5%-ный раствор хлористого бария до полного осаждения,

т.е. до тех пор, пока новая капля хлористого бария не будет вызывать

14

образования мути. Выпавший белый осадок сернокислого бария отфильтровывают;

2) в фильтрат проходят растворимые в воде бариевые соли эфиросерных кислот – соединений серной кислоты с фенолом, индоксилом и др. Для их обнаружения кислый фильтрат помещают в кипящую водяную бань и кипятят в течение 5-10 мин. Снова появляется муть. Появление мути обусловлено освобождением серной кислоты в результате гидролиза эфиросерных кислот с образованием новой порции сернокислого бария.

1.3 Лабораторная работа № 3. Определение концентрации сахара

крови

Сахар в крови у абсолютно здоровых людей всегда поддерживается на

определенном уровне, а в моче совсем отсутствует. В плазме содержание сахара

вкрови составляет в среднем 0,1 %. В сохранении определенного уровня сахара

вкрови основную роль играет печень. При большом поступлении сахара в организм, его излишек откладывается в печени и поступает в кровь, когда сахар

вкрови падает. В печени углеводы содержатся в виде гликогена (рисунок 2).

Гликоген - основная форма запаса углеводов, в растениях эту роль играет

крахмал. Гликоген - полисахарид, откладывающийся в виде гранул в цитоплазме клеток и расщепляющийся до глюкозы при недостатке ее в организме. Гликоген запасается главным образом в печени (до 6 % от массы печени) и в мышцах, где его содержание редко превышает 1 %. Запасы углеводов в организме

15

нормального взрослого человека (массой 70 кг) после приема пищи составляют около 325 г.

Рисунок 2 – Структурная формула гликогена

Основная функция мышечного гликогена состоит в том, что он является легкодоступным источником гексозных единиц, используемых в ходе гликолиза в самой мышце. Гликоген печени используется для поддержания физиологических концентраций глюкозы в крови в промежутках между приемами пищи. Через 12-18 часов после приема пищи запас гликогена в печени почти полностью истощается. Содержание мышечного гликогена сильно снижается только после продолжительной и напряженной физической работы.

При употреблении в пищу крахмала сахар в крови заметным изменениям не подвергается, так как расщепление крахмала в пищеварительном тракте длится продолжительное время, а образовавшиеся при этом моносахариды всасываются медленно. При поступлении значительного количества (от 150 до 200 г)

обычного сахара или глюкозы сахар в крови резко повышается.

Такое повышение сахара в крови называется пищевой или алиментарной гипергликемией. Избыточный сахар в крови выводится почками, а в моче появляется глюкоза (рисунок 3).

16

организм получает недостаточное количество инсулина и, несмотря на повышенное содержание глюкозы в крови, клетки начинают страдать от ее недостатка.

Для того, чтобы поставить диагноз сахарного диабета, необходимо точно определить уровень содержания сахара в крови: при повышении уровня сахара крови натощак (время последнего приема пищи не менее 8 часов) более

7,0 ммоль/л дважды в разные дни, то диагноз сахарного диабета не вызывает сомнения.

Когда показатели сахара в крови натощак менее 7,0 ммоль/л, но более

5,6 ммоль/л для уточнения состояния углеводного обмена необходимо провести глюкозотолерантный тест. Процедура проведения данного теста заключается в следующем: после определения содержания сахара в крови натощак (период голодания не менее 10 часов), необходимо принять 75 г глюкозы. Следующее измерение уровня сахара в крови производят через 2 часа. Если сахар в крови более 11,1 ммоль/л, можно говорить о наличии сахарного диабета. Если сахар в крови менее 11,1 ммоль/л, но более 7,8 ммоль/л - говорят о нарушении толерантности к углеводам. При более низких показателях уровня сахара в крови пробу следует повторить через 3-6 месяцев.

Одним из наиболее распространенных состояний, связанных с диабетом,

является пониженный сахар в крови - гипогликемия. Это явление имеет место в тех случаях, когда уровень сахара в крови падает ниже удовлетворяющего потребность организма. Причиной этому может послужить несвоевременное употребление пищи, принятие слишком большой дозы инсулина или других медикаментов, интенсивные физические нагрузки. В связи с этим, каждый больной диабетом должен всегда иметь под рукой глюкометр, позволяющий своевременно выявлять отклонение уровня сахара в крови от нормы.

Пониженный сахар в крови у больных диабетом может развиться из-за нарушения работы почек, а также в результате резкого похудения. В этих случаях особенно важно держать показатели сахара в крови под контролем.

18

Снижение уровня глюкозы в крови ниже 3,3 ммоль/л (гипогликемия)

чревато нарушением работоспособности всех органов, и в первую очередь головного мозга. Возникает выраженная слабость, чувство голода,

головокружение, тремор конечностей, спутанность сознания. В таком состоянии человек теряет работоспособность. При прогрессировании гипогликемии может развиться гипогликемическая кома.

Повышение уровня глюкозы более 5,5 ммоль/л (гипергликемия) на короткий промежуток времени возникает как физиологическое состояние после приема пищи, особенно богатой углеводами. Кратковременное повышение сахара в крови ничем страшным для организма человека не грозит, а вот постоянное повышение уровня сахара в крови, которое наблюдается при сахарном диабете, чревато для организма многими осложнениями (ангиопатия,

нефропатия, ретинопатия и другие). При повышении же уровня сахара в крови при проведении анализа крови на глюкозу, который проводится натощак,

показано проведение глюкозотолерантного теста.

1.3.1 Определение концентрации сахара по Хагедорну-Иенсену

В организме человека и животных углеводы играют важную роль,

выполняя разнообразные функции. Они служат источником энергии и пластическим материалом клеток, а также используются в качестве исходных продуктов синтеза липидов, белков и нуклеиновых кислот. Организм человека и животных не способен синтезировать углеводы из неорганических веществ и получает их в готовом виде с различными пищевыми продуктами главным образом растительного происхождения. Углеводы, поступившие в организм,

подвергаются перевариванию в желудочно-кишечном тракте и всасываются в кровь в виде моносахаридов, в основном глюкозы. В норме кровь всегда содержит довольно постоянное количество сахара. Содержание сахара в крови у

19

взрослого здорового человека составляет в среднем 100 мг % и колеблется от 80

до 120 мг %.

При некоторых заболеваниях, например при диабете, акромегалии,

гипертиреозе, гепатите, циррозе печени и гликогеновой болезни содержание сахара в крови увеличивается до 220-400 мг %, такое состояние называют гипергликемией. После принятия пищи, богатой углеводами, также имеет место повышение содержания глюкозы в крови – алиментарная гипергликемия,

которая в отличие от патологической гипергликемии непродолжительна. Может наблюдаться и снижение содержания сахара ниже 70 мг %, тогда говорят о гипогликемии.

Установление гипер- и гипогликемии имеет большое диагностическое значение в клинических анализах как для человека, так и для животных. Ниже приведена таблица значений концентрации глюкозы в крови у различных сельскохозяйственных животных (таблица 3).

Таблица 3 - Концентрация глюкозы в крови у различных

сельскохозяйственных животных

Микрометод Хагедорна - Иенсена был предложен для количественного определения глюкозы в крови. Однако он не специфичен и может быть использован также для определения других моносахаридов (и некоторых дисахаридов), хотя в этом случае вводятся некоторые поправки при расчетах.

20