Биоорганическая химия. Учебное пособие

Тема 24. Система противосвертывания

тируется как обладающий активностью одноцепочный гликопро теин, состоящий из 635 аминокислотных остатков. N концевая область ПрS состоит из Glа домена и 4 EGF доменов. Расщепле ние дисульфидного мостика между Gla доменом и 1 м EGF до меном тромбином приводит к инактивации ПрS. ПрS связывается с высоким сродством с С4b связывающим белком системы ком племента, этот комплекс не обладает антикоагулянтной актив ностью. ПрS, обладающий высоким сродством к фосфолипидам, может участвовать также и в локальной регуляции воспалитель ного процесса.

Факторы IХа и Ха в составе протромбиназного комплекса на поверхности фосфолипидов защищены от действия антитромбина III из за препятствий, создаваемых компонентами комплекса. Ан титромбин III активируется на поверхности неповрежденного эн дотелия, а активированные факторы свертывания крови образуют ся на фрагментах мембран клеток или тромбоцитах, тем самым они пространственно разобщены. Когда тромбин вымывается потоком крови из места образования и контактирует с неповрежденными эндотелиальными клетками, то он может инактивироваться анти тромбином III или связаться с ТМ и активировать ПрС. ПрС, действуя каталитически, расщепляет активированные формы факторов V и VII, что вызывает распад комплексов и подавление свертывания, а свободные формы факторов IХа и Ха могут инги бироваться антитромбином III при контакте с эндотелием.

Ингибиторы ПрСа относятся к семейству серпинов: ингиби тор ПрС, α1 антитрипсин и протеазный нексин 1; скорость инак тивации ПрСа ниже, чем тромбина. Гепарин увеличивает скорость инактивации ПрСа, но меньше, чем скорость инактивации тром бина. Гепарин выполняет роль матрицы, на которой происходит взаимодействие ПрСа с ингибитором. В инактивации ПрСа в плаз ме могут быть α2 антиплазмин и α2 макроглобулин, а также ИПТФ в присутствии гепарина.

Наследственный и приобретенный дефицит ПрС или ПрS, как и дефицит антитромбина III, явлется фактором риска развития венозных тромбозов и тромбоэмболий. При гетерозиготной форме дефицита вероятность развития тромбозов появляется в возрасте старше 14 лет, особенно в сочетании травмы, операции, иммобили

261

Тема 24. Система противосвертывания

зации больного, беременности, использовании пероральных конт рацептивов. При дефиците ПрС/ПрS более высока вероятность развития тромбофлебитов; при дефицитите антитромбина III бо лее высока вероятность развития тромбозов при беременности

иприеме пероральных контрацептивов. Дефицит ПрS предраспо лагает к развитию артериальных тромбозов в молодом возрасте. Гомозиготный дефицит ПрС и ПрS встречается крайне редко. Часто та гетерозиготного дефицита ПрС составляет 1 случай на 300 человек. Чаще встречается снижение функциональной активно сти обоих белков. Охарактеризовано около 30 нуклеотидных за мен в ДНК, кодирующей ПрС; чаще это происходит в результате превращения 5 метилцитозина в тимин вследствие дезаминиро вания в нуклеотидной паре CpG. Изменение соотношения между свободной и связанной с С4b–СБ формами ПрS, видимо, лежит в основе приобретенного дефицита ПрS при нефротическом синд роме, когда нарушение реабсорбции белков в проксимальных ка нальцах нефрона приводит к выходу свободного ПрS в мочу, а высокомолекулярный комплекс ПрS с С4b–СБ не подвергается клубочковой фильтрации. Снижение концентраций ПрS и ПрС определяется при беременности, заболеваниях печени, ДВС. Для лечения и профилактики повторных тромбозов у больных с дефи цитом этих белков применяют антагонисты витамина К. В начале терапии развивается транзиторное состояние гиперкоагуляции, обусловленное более быстрым снижением концентрации ПрС

иПрS, чем витамин К зависимых факторов свертывания, которое может привести к некрозу кожи у больных с исходно сниженным уровнем ПрS или ПрС. Поэтому начинают прием антагонистов ви тамина К на фоне гепаринотерапии и только после достижения тре буемого стабильного уровня антикоагуляции отменяют гепарин.

КПрСа у 10–20% больных, страдающих тромбозом глубоких вен, обнаружена резистентность.

2. Патология системы противосвертывания. Наследственный и приобретенный дефицит антитромбина III.

Наследование дефицита антитромбина III аутосомно доминант ное, частота — 1 случай на 2000–5000 человек, причем с возрастом частота возрастает. Клинические проявления: тромбозы глубоких вен, тромэмболия легочной артерии. Частота выявления дефицита

262

Тема 24. Система противосвертывания

антитромбина III у больных с венозными тромбозами — 3%. Даже при отсутствии клинических признаков тромбозов в плазме значи тельно повышено содержание фрагмента F1 + 2, который отщеп ляется при активации от протромбина. Такой повышенный уровень фоновой активации свертывания крови, характерный для дефи цита антитромбина III, увеличивает возможность тромбообразо вания, особенно при присутствии факторов риска (травма, опера ция, инфекция, беременность, роды, употребление пероральных контрацептивов). Чаще всего выявляют тип I дефицита анти тромбина III, при котором понижены его функциональная актив ность и его концентрация. Тип II дефицита антитромбина III от личается нормальным уровнем его в плазме, но свойства его изменены. Возможны изменения нескольких функций: не обра зуется дисульфидная связь между Cys430 и Cys247, что приводит к значительному изменению третичной структуры ингибитора

иего способности взаимодействовать с протеазами и гепарином или нарушению взаимодействия с протеазой и гепарином.

Приобретенный дефицит антитромбина III является резуль татом сниженного синтеза, повышенного потребления, потери белка при нефротическом синдроме и заболеваниях желудочно кишечного тракта. Всегда снижаются концентрация и активность антитромбина III. Развитие тромбогеморрагического синдрома сопровождается снижением антитромбина III; если это снижение на начальных этапах еще не достигло критического уровня, то те рапия гепарином может быть эффективной. Но антикоагулянт ное действие гепарина определяется уровнем антитромбина III

ипри снижении уровня антитромбина III необходимо введение большего количества гепарина, чем при нормальном содержании антитромбина III. Но интенсивная гепаринизация может при вести к дальнейшему снижению уровня антитромбина III, обуслов ленному увеличением его потребления. Снижение антитромбина III происходит при лечении эстрогенами.

Антифосфолипидный синдром

АТ к фосфолипидам появляются при многих заболеваниях, могут быть вызваны приемом некоторых лекарственных препара тов. АТ могут быть представлены иммуноглобудинами классов G, M или А, антитела образуются к белок фосфолипидным комплек сам. Антитела к фосфолипидам могут нарушать следующие мемб

263

Тема 25. Система фибринолиза

ранозависимые реакции системы гемостаза: синтез и секрецию вазоактивных соединений; активацию витамин К зависимых фак торов свертывания; активацию ПрС; инактивацию факторов Vа

иVIIа комплексов ПрСа—ПрS; активацию антитромбина III гли копротеинами эндотелия. Способность антител к фосфолипидам ингибировать основные реакции системы противосвертывания при наличии прокоагулянтного влияния на тромбоциты и эндо телий, приводит к тому, что у больных с антифосфолипидным синдромом риск развития тромбозов значительно выше риска кровотечений. Клинически антифосфолипидный синдром про является рецидивирующими тромбозами различной локализа ции; тромбы развиваются в венозных (70%) и артериальных (30%) сосудах, также в системе микроциркуляции. При повторных спонтанных выкидышах и внутриутробной гибели плода, причиной которых могут быть тромбозы сосудов плаценты, АТ к фосфолипи дам обнаруживаются в 50% случаев. При антифосфолипидном синд роме выявляются тромбофлебит глубоких вен голени, цереброва скулярные нарушения, обусловленные тромбозом сосудов мозга; на коже появляется рисунок, напоминающий ячейки рыболов ной сети, чаще локализованный в области нижних конечностей

иобусловленный васкулитом. Возможно развитие легочной ги пертензии, синдрома Бадда Киари (симптомы внутрипеченочной портальной гипертензии), инфаркта миокарда, гемолитической ане мии, тромбоцитопении, тромботического неинфекционного эндо кардита, асептического некроза головок бедренных костей.

Тема 25. СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА

1. Основные компоненты системы фибринолиза. Фибрин обеспе чивает остановку кровотечения в местах повреждения сосудов; после выполнения гемостатической функции и регенерации тканей необходимо удаление фибрина для восстановления нормального кровотока, что обеспечивается фибринолитической системой, со стоящей из профермента (плазминогена), ферментов, превращаю щих Пг в сериновую протеазу, сложной системой ингибиторов, кон тролирующих как активацию Пг, так и сам процесс лизиса фибрина.

264

Тема 25. Система фибринолиза

Кроме удаления внутрисосудистых тромбов, компоненты системы фибринолиза участвуют в разрушении внеклеточного матрикса и выполняют важную функцию в регуляции эмбриогенеза, регене рации тканей, роста и метастазирования опухолей.

Плазминоген и плазмин. Фермент, непосредственно расщеп ляющий фибрин — плазмин (ПЛ), образующийся при активации Пг. Пг синтезируется в печени и секретируется как одноцепочеч ный белок, состоящий из 790 аминокислотных остатков и содержа щий Glu в качестве N концевой аминокислоты, но в плазме при сутствует в виденескольких изоформ. Плазмин легко расщепляет

3 связи — Arg67–Met68, Lys76–Lys77 или Lys77–Val78 в молекуле Пг с высвобождением N концевого полипептида. Третичная структура

Пг отличается высокой стабильностью, которая обеспечивается 24 дисульфидными мостиками. Активация Пг происходит в результате расщепления связи Arg561–Val562 c образованием фермента, состоя щего из 2 цепей, соединенных 2 дисульфидными мостиками. Активный центр находится в легкой В цепи. Легкая цепь — ма лоспецифическая трипсиноподобная протеаза, способная расщеп лять практически все белки плазмы.

265

Тема 25. Система фибринолиза

2. Ингибиторы лизиса фибрина. α2 антиплазмин относится к се мейству серпинов, синтезируется в печени и секретируется как од ноцепочечный гликопротеин, состоящий из 464 аминокислотных остатков, в крови присутствует в виде 2 форм, которые ингибируют плазмин в растворе с одинаковой скоростью. α2 АП ингибирует свободный плазмин с очень высокой скоростью, реакция проте кает в 2 стадии: вначале быстро образуется обратимый комплекс α2 АП—плазмин, в котором затем происходит медленное расщеп ление α2 АП по реактивному центру Arg354–Met355. В присутствии быстродействующего ингибитора этот фермент может проявлять свою активность только в месте образования до тех пор, пока ос тается связанным с фибрином.

Кроме ингибирования плазмина в кровотоке, α2 АП участвует в стабилизации фибрина. При полимеризации в фибрин вклю

266

Тема 25. Система фибринолиза

чаются как Пг, так и α2 АП в примерно равном количестве; причем α2 АП связывается, а затем и сшивается фактором XIIIа с С концевой областью α цепи фибрина, которая в первую очередь расщепляет ся под действием плазмина. Сшитый с фибрином α2 АП инакти вирует плазмин, образовавшийся из связанного при полимериза ции Пг, после расщепления С концевой области α цепи фибрина, которое еще не приводит к распаду полимера, но открывает новые участки связывания с высоким сродством Пг к тАП. Расщепление фибрина до растворимых фрагментов происходит после актива ции Пг, связывающегося с частично разрушенным фибрином. Наличие двух стадий в лизисе фибрина представляет собой меха низм, обеспечивающий смещение во времени процессов образо вания и лизиса фибрина. Кроме того, тот факт, что растворение фибрина происходит путем связывания с ним Пг из кровотока, обеспечивает протекание лизиса с поверхности тромба, что пре дотвращает образование эмболов.

α2 макроглобулин (α2 МГ) — полифункциональный ингиби тор протеаз, гликопротеин с молекулярной массой 725 кДж, состоя щий из 4 идентичных субъединиц. Расщепление пептидных связей приводит к конформационным изменениям α2 МГ, в результате которых гидролизуется тиоэфирная связь между Cys949 и Gln952, а карбонильный радикал образует ковалентную связь с протеазой, но в отличие от серпинов — не по активному центру. Поэтому комплекс протеаза—α2 МГ сохраняет способность расщеплять низкомолекулярные субстраты, а взаимодействие с белками ста новится невозможным. Комплекс протеаза—α2 МГ связывается с рецепторами на фибробластах, макрофагах и клетках ретикулоэн дотелиальной системы, переносится внутрь клеток и расщепляет ся лизосомальными протеазами. α2 МГ ингибирует плазмин с мень шей скоростью, чем α2 АП.

Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (АТИФ) был выделен как карбоксипептидаза, специфически отщепляю щая С концевые остатки Lys, которые экспонируются после частичного расщепления фибрина и формируют новые участки связывания тАП и Пг, это приводит к снижению скорости лизиса фибрина.

267

Тема 25. Система фибринолиза

Свободный тромбин активирует АТИФ с низкой скоростью, поэтому антифибринолитический эффект этого ингибитора зави сит от количества тромбина, образующегося при активации сверты вания крови. Компоненты ПрС влияют на АТИФ разнонаправлен но. Активация ПрС и расщепление фактора Vа снижают количество образующегося тромбина, что должно приводить к снижению ско рости активации АТИФ. Одновременно связывание тромбина с ТМ приводит не только к активации ПрС, но и к многократному увеличению скорости активации АТИФ комплексом тромбин—ТМ.

Ингибитором фибринолиза следует считать и богатый гистиди ном гликопротеин (БГГ) — белок с молекулярной массой 75 кДж, который обнаружен в плазме и тромбоцитах, из которых секрети руются пи активации; обладает высоким сродством к лизинсвязы вающему центру 1 Пг и может служить конкурентным ингибитором взаимодействия Пг с фибрином. В плазме примерно половина Пг находится в комплексе с БГГ, обладающим низким сродством к фибрину. БГГ, который секретируется активированными тром боцитами, связывается с их поверхностью и выполняет роль бу фера, обеспечивающего накопление Пг в области тромбообразо вания.

Расщепление фибриногена и фибрина плазмином. Плазмин расщепляет пептидные связи фибриногена в определенном по рядке с образованием продуктов разрушения, обозначаемых как Х , Y , D , E фрагменты. Наиболее чувствительной к протеолизу оказывается С концевая часть α цепи; затем происходит отщеп ление N концевого пептида β цепи. Хотя фибриноген представ ляет симметричную структуру, отщепление по отмеченным остат кам может протекать асимметрично с образованием набора Х фрагментов, имеющих молекулярную массу от 330 до 240 кДж. Х фрагменты под действием тромбина могут полимеризоваться, но с меньшей скоростью, чем нативный фибриноген. Полная по теря свертываемости происходит после отщепления одного из D фрагментов, содержащего периферический участок полимериза ции. Далее Y фрагмент может расщепляться на начальные D и Е фрагменты, которые после отщепления нескольких коротких пептидов превращаются в конечные фрагменты с молекулярной

268

Тема 25. Система фибринолиза

массой 80 кДж (D фрагмент) и 50 кД (Е фрагмент). Расщепление связей в сшитом фибрине происходит в такой же последователь ности, как в расщеплении фибриногена. В плазме растворимые фрагменты фибрина — набор фрагментов, состоящих из D диме ра, связанного ковалентно или нековалентно с Е фрагментами.

3. Активаторы плазминогена. Тканевый активатор плазмино гена (тАП) синтезируется клетками эндотелия и секретируется как одноцепочечный гликопротеин молекулярной массой 70 кДж; имеет две формы, отличающиеся по содержанию углеводов. Сте пень гликозилирования тАП влияет на кинематику активации Пг. Третичная структура тАП состоит из пальцевидного домена фиб ронектина, домена фактора роста эпидермиса, 2 крингл доме нов и протеазного домена. Домен фибронектина и крингл 2 со держат участки связывания тАП с фибрином. Активный центр

образуют остатки His322, Asp371, Ser478. Свободный Пг активирует тАП с очень низкой скоростью. Фибрин связывает тАП и Пг. Об

разование комплекса фибрин тАП—Пг на 3 порядка увеличивает каталитическую эффективность активации Пг. В процессе разру шения фибрина плазмином на нем экспонируются новые участки связывания Пг с высоким сродством и происходит дальнейшее увеличение скорости активации Пг. ТАП имеет короткий t 1/2

вкровотоке, клиренс клетками печени обусловливает фазу быст рого снижения концентрации тАП и обратимым связыванием с эндотелием; фаза медленного снижения — результат поступления

вкровь активатора, ранее депонированного на эндотелии. Гепато циты содержат рецептор, гомологичный рецептору липопротеи нов низкой плотности, который связывает как свободный тАП, так и его комплекс с ингибитором; этот рецептор участвует в свя

зывании и интернализации и других протеаз, инактивированных α2 МГ. Многие типы клеток специфически связывают Пг. Рецеп торы тПА на мембранах клеток, а также белки межклеточного мат рикса (тромбоспондин, желатин, коллаген IV типа) могут стиму лировать активацию связанного с мембранами Пг под действием тАП, но их кофакторная активность значительно меньше, чем у фибрина.

269

Тема 25. Система фибринолиза

Урокиназа — трипсиноподобная протеаза, активирующая Пг, впервые была выделена из мочи. Клетки секретируют урокиназу

ввиде одноцепочечного белка. При инкубации Пг с одноцепо чечной урокиназой происходит взаимная активация профермен тов. Связывание Пг с одноцепочечной урокиназой может приво дить к конформационным изменениям, в результате которых формируется активный центр, обеспечивающий начальную акти вацию Пг. Одноцепочечный активатор Пг урокиназного типа синтезируется клетками как белок с молекулярной масой 54 кДж, состоящий из 411 аминокислотных остатков; вторичная структу ра состоит из 3 участков, включающих крингл и каталитический домен. Плазмин и калликреин расщепляют связь Lys158–Ile159,

вкотором легкая (N концевая) и тяжелая (С концевая) цепи свя заны дисульфидным мостиком. Тромбин специфически расщеп

ляет Arg156–Phe157 с образованием двухцепочечной формы, обла дающей заметной тромболитической активностью. Урокиназа не обладает высоким сродством к фибрину, но при внутривенном введении вызывает лизис тромбов без выраженной активации Пг

вкровотоке. Урокиназа синтезируется различными типами кле ток: фибробластами, эпителиальными клетками, пневмоцитами, децидуальными клетками плаценты, макрофагами, эндотелиаль ными клетками под действием различных стимулов. Связывание урокиназы со специфическим рецептором многих клеток активи рует сигналпроводящую систему, дифференциацию клеток, хемо таксис нейтрофилов и миграцию клеток эндотелия. Связанная с ре цептором урокиназа активирует Пг и латентные металлопротеазы

вмежклеточном пространстве, что обеспечивает разрушение вне клеточного матрикса, необходимого для роста, деления и мигра ции клеток. Повышенное содержание урокиназы, ее рецепторов и ИАП 1 в клетках опухолей ассоциируется с ростом и метастази рованием опухолей и плохим прогнозом заболевания.

Ингибиторы активаторов плазиногена (ИАП 1). ТАП непре рывно секретируется эндотелием как активный фермент, но в кро ви он быстро инактивируется; наиболее эффективный ингибитор тАП и урокиназы — белок из семейства серпинов. ИАП 1 — глико протеин с молекулярной массой 52 кДж, состоящий из 379 амино

270