Биоорганическая химия. Учебное пособие

Тема 22. Детоксицирующая функция печени

Первый лабораторный признак холестаза — повышение кон центрации конъюгированного билирубина и, как результат этого, возрастание общего билирубина (отношение прямой билиру бин/непрямой билирубин более 3).

Ферментные индикаторы холестаза.

Щелочная фосфатаза является фосфогидролазой моноэфи ров ортофосфорной кислоты, наибольшая ее актвность в печени; располагается на поверхности плазматических мембран; подъем активности фермента в сыворотке крови при холестазе является результатом спровоцированного холестазом повышенного синтеза фермента, извлечением фермента с поверхности мембран гепато цитов желчными кислотами, выделения мембранных ферментов под действием желчных кислот, поступления свободного и мемб раносвязанного фермента в циркуляцию. При внепеченочном хо лестазе активность фермента повышена.

Гамма глутамил транспептидаза — катализирует перенос γ глутамила на аминокислоту или пептид на другую молекулу суб страта при присединении воды и имеет значение в метаболизме аминокислот. Предполагают, что в печени связывает молекулы ве ществ, которые необходимо экскретировать. Фермент содержится в мембранах клеток печени, обладающих высокой секреторной ак тивностью: эпителиальные клетки, выстилающие желчные пути, печеночные канальца. Наиболее часто увеличение активности фер мента при заболеваниях печени и желчевыводящих путей является результатом нарушения оттока желчи и повышения содержания фермента в гепатоцитах, всегда сопровождает внутри и внепече ночную обтурацию желчных протоков, вторичное вовлечение пече ни в онкологический процесс путем метастазирования. Менее высокая активность фермента соответствует острому гепатоцел люлярному поражению.

Дополнительными ферментами в диагностике нарушения жел чеобразования являются 5 нуклеотидаза, лейцинаминопептидаза, участвующие в процессах регенерации печеночной паренхимы. Обычный спутник постепенного прогрессирования механической желтухи — появление холестатических липопротеинов, таких как

241

Тема 22. Детоксицирующая функция печени

ЛП Х и медленный ЛПВП S. Для неосложненного желтухой хо лестаза характерно повышение в крови общего холестерина, три глицеридов, холестерина, липопротеинов очень низкой и низкой плотности. При стойкой билирубинемии отрицательная реакция на стеркобилин в кале указывает на холестаз. В моче при этом появляют ся желчные пигменты при стойкой отрицательной реакции на би лирубин. Паренхиматозный компонент желтухи определяется по активности индикаторов гепатоцитолиза — возрастании доли не конъюгированного билирубина и активности трансфераз. Актив ность аминотрансфераз, превышающая нормальные значения более чем в 10–15 раз, наблюдается на ранних стадиях острого ви русного гепатита.

Клетка печени содержит больше АСТ, чем АЛТ, но АСТ имеет ся как в митохондриях, так и цитоплазме. В цитоплазме, где со держится только АЛТ, ее концентрация выше, чем АСТ. Измене ние соотношения АСТ/АЛТ может быть причиной изменения их освобождения, синтеза, метаболических превращений. Коэффи циент de`Ritis АСТ/АЛТ при цитолитическом синдроме менее 1.

Билирубин обладает широким спектром токсического влия ния, являясь цитотоксином. Встраиваясь в мембраны и проникая в клетку, он повреждает липиды митохондрий, вызывая их необра тимые изменения. Билирубин ингибирует свертывание, утилиза цию глюкозы клетками, нарушает активность ферментов, ионную клеточную проницаемость. В присутствии жирных кислот токсич ность билирубина повышается в несколько раз. Токсикоз при обту рации желчных ходов характеризуется присутствием в крови избы точного количества неконъюгированного и конъюгированного билирубина и других компонентов желчи. Образование в обход па ренхимы патологических сосудистых шунтов выдвигает на первый план интоксикацию продуктами жизнедеятельности кишечных бактерий, трансформирующих триптофан в индол и скатол, метио нин и его производные — в меркаптаны, а также некоторое количест во аммиака, фенолов и оболочечных полисахаридов. Накопление цитотоксических продуктов в тканях и гепатоцитах ведет к разоб щению окислительного фосфорилирования, способствует пере ходу окислительно восстановительных реакций в клетках печени

242

Тема 23. Система свертывания крови

на путь анаэробного гликолиза. Вследствие накопления недоокис ленных продуктов развивается внут риклеточный ацидоз, умень шается содержание АТФ в митохондриях, нарушается водно электролитный обмен. Поступление лизосомальных гидролаз в кровь активирует систему фибринолиза, приводит к образова нию большого количества среднемолекулярных пептидов, резко изменяющих тонус и проницаемость сосудов и клеточных мемб ран. Накапливающиеся в тканях билирубин, свободные желчные кислоты, щелочная фосфатаза, аммиак, фенолы, ацетон, холе стерин оказывают прямое цитотоксическое действие. Следствием повреждения гепатоцитов при механической желтухе является пе реход подпеченочного холестаза во внут рипеченочный.

Тема 23. СИСТЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

1. Общие сведения о факторах свертывания. Система свертыва ния крови обеспечивает жидкое состояние крови в кровеносных сосудах и тромбообразование при повреждении сосудистой стен ки; представляет собой стадийный процесс — локальная вазокон стрикция, формирование тромбоцитарного тромба, стабилизация его фибрином, ретракция тромба, растворение тромба после вос становления поврежденной стенки сосуда. Процесс свертывания крови обеспечивается взаимодействием клеток крови, плазмен ных факторов свертывания крови, эндотелиальных и субэндоте лиальных структур. Условно принято выделять процессы сверты вания, противосвертывания и фибринолиза.

243

Тема 23. Система свертывания крови

Продолжение табл.13

244

Тема 23. Система свертывания крови

Окончание табл.13

Основной механизм активации свертывания крови — ограни ченный протеолиз: в активированной форме 6 плазменных факто ров и калликреин представляют собой специализированные се риновые протеазы. Протеазные домены происходят из С концевых частей молекул проферментов. Селективность действия протеаз системы свертывания крови зависит от специфических структур N концевых частей молекул.

В N концевой части протромбина, факторов Х, IX, VII, про теинов C, S содержится до 12 остатков γ карбоксиглутаминовой ктслоты (Gla), которые связывают ионы кальция, что обеспечивает стабилизацию структур белков и необходимы для эффективного взаимодействия факторов с фосфолипидами. Дефицит витамина К приводит к снижению степени γ карбоксилирования и гепатоциты секрети руют факторы с низкой функциональной активностью.

Протромбин, фактор ХII и ферменты системы фибринолиза содержат участки, состоящие из приблизительно 80 аминокис лотных остатков, которые образуют петлю, в стабилизации струк туры которой важны 3 дисульфидных мостика и боковые цепи аминокислот. Значительная вариабельность участков в наружной части петли обеспечивает специфичность взаимодействия с дру гими компонентами системы гемостаза.

245

Тема 23. Система свертывания крови

Факторы VII, X, IX, XII содержат последовательность из при мерно 50 аминокислот, обеспечивающих связывание факторов со специфическими рецепторами на поверхности клеток или рецеп торными доменами факторов V и VIII.

Протромбин, факторы VII, Х, IX содержат 5 членную после довательность Phe–Trp–X–X–Tyr, в которой ароматические бо ковые цепи аминокислот экспонированы наружу, что создает гид рофобный участок, взаимодействующий с мембранами клеток.

Фактор XII содержит 2 участка, гомологичных фрагментам фибронектина типа I и II; предположительно фрагмент типа II фиб ронектина принимает участие во взаимодействии с коллагеном.

Фактор XIII имеет плазменную и тромбоцитарную формы. Плазменная форма представляет собой тетрамер, состоящий из 2 пар цепей (α и β ), тромбоцитарная содержит только α цепи. Ак тивация плазменной формы фактора XIII протекает в 2 этапа: вначале под действием тромбина или фактора Xа происходит рас щепление α цепей с освобождением пептида активации, затем тет рамер распадается с образованием активного фермента, состоя щего из 2 α цепей.

Фактор XIIIа катализирует образование ковалентных связей между полипептидами в комплексах белков, под его действием про исходит сшивание смежных молекул фибрин мономеров в полиме ре и сшивание с фибрином α2 антиплазмина, коллагена и фибро нектина.

В регуляции активности протеаз свертывания крови участвуют V и VIII факторы, гомологичные белки, обеспечивающие связы вание витамин К зависимых факторов IХa и Xa и их субстратов (факторов Х и протромбина) с фосфолипидами. Множественные связи в этих комплексах обеспечивают эффективное взаимодей ствие ферментов с субстратами и многократное увеличение эф фективности реакций активации. Факторы V и VIII синтезируют ся как полипептиды, состоящие соответственно из 2196 и 2332 аминокислотных остатков. Фактор VIII легко подвергается про теолизу в концевой С области В домена и обнаруживается в плаз ме в виде набора гетеродимеров, взаимодействующих при участии

246

Тема 23. Система свертывания крови

Са2+. Активируются факторы V и VIII под действием тромбина или фактора Ха. В плазме фактор VIII циркулирует в виде комп лекса с фактором Виллебранда (фФВ — адгезивным белком), обеспечивающим связывание тромбоцитов с субэндотелиальны ми структурами и склеивание тромбоцитов при их агрегации. фФВ имеет и другие функции: повышение стабильности фактора VIII и защиту его от инактивации протеином С; он синтезируется толь ко в мегакариоцитах и клетках эндотелия как полипептид, со стоящий из 2050 аминокислотных остатков с образованием ком плексов с молекулярной массой 20 000 кДж. Димеры фФВ постоянно секретируются в плазму. Мультимеры фФВ находятся в α гранулах тромбоцитов и тельцах Вайбеля Паладе эндотелия и секретируются из них при активации тромбоцитов или повреж дении эндотелия. Мультимеры фФВ имеют ведущую роль в адге зии тромбоцитов и образовании тромбоцитарных агрегатов в усло виях высокого напряжения сдвига, которое специфично для сосудов мелкого диаметра и стенозированных участков артерий.

Тканевый фактор (ТФ) — трансмембранный гликопротеин, выполняющий функции рецептора фактора VII и модулятора его активности. Кофакторная активность ТФ определяется апобел ком и фосфолипидами мембраны клеток. Связь фактора VII с ТФ приводит к изменению структуры фактора VII, делая возможным его расщепление на двухцепочную форму, которая в комплексе с ТФ активирует факторы свертывания крови X и IX, что иниции рует каскад реакций свертывания. ТФ является конститутивным компонентом мембран некоторых типов клеток, которые не кон тактируют с плазмой крови. Высокое содержание ТФ характерно для коры головного мозга, миокарда, клеток эпидермиса и эпите лия. Клетки эндотелия и моноциты способны экспрессировать ТФ под воздействием медиаторов воспаления, эндотоксина, окис лен ных липопротеинов низкой плотности и иммунных комплексов, что может быть одной из причин активации внутрисосудистого свертывания крови. ТФ состоит из 263 аминокислотных остатков, являясь отдаленным представителем суперсемейства белков, включающего рецепторы гормона роста, ИЛ 1 7 и ИФН (α и β ).

247

Тема 23. Система свертывания крови

Функция ТФ заключается не только в активации свертывания крови. Связывание фактора VIIа с ТФ вызывает Са2+ сигналы в клетках, стимулирует миграцию гладкомышечных клеток, рост и метастазирование опухоли. Изолированное повреждение гена ТФ приводит к аномалиям развития сосудов.

Фибриноген состоит из 3 пар неидентичных полипептидных цепей, его молекула симметрична, вытянута, слегка изогнута и имеет размер 7°48 нм. N концевые части всех 3 полипептидов образуют центральную область взаимодействия 2 половин молекулы фи бриногена (Е домен), которые ковалентно связаны между собой 3 дисульфидными мостиками; далее следует область, в которой все 3 субъединицы закручены в суперспираль длиной примерно 16 нм. Примерно посреди суперспирали имеется короткая область нару шения регулярности структуры, которая является одним из участ ков специфического расщепления плазмином. С концевые фраг менты β и γ цепей образуют на концах молекулы фибрина глобулы. В агрегации тромбоцитов фибриноген выполняет роль мостиков, связывающих между собой активированные клетки. При активации на поверхности тромбоцитов открываются специ фические рецепторы, состоящие из гликопротеинов Iib и IIIа, взаимодействующих с аминокислотными последовательностями, имеющимися в С концевых областях α цепи и γ цепи фибриногена. Полимеризация фибриногена начинается после отщепления тром бином N концевого фибринопептида А и открытия в α цепи участ ка Gly—Pro—Arg, взаимодействующего с комплементарным участ ком в С концевой части γ цепи. Этого достаточно для инициации процесса самосборки протофибрилл, в которых периферический D домен одной молекулы взаимодействует с центральным Е до меном другой молекулы. Ветвление волокон с образованием трех мерной фибриновой сетки происходит с участием С концевых доменов α цепей и является необходимым этапом формирования прочного геля. Механическая стабильность фибрина и его устой чивость к лизису повышаются, когда под действием фактора XII Iа образуются ковалентные связи между смежными мономерами

248

Тема 23. Система свертывания крови

фибрина в полимере. Вначале между собой попарно сшиваются α цепи, затем сшиваются β цепи фибриногена с образованием длин ных полимеров. Последовательность каждой из цепей фибриногена кодируется соответствующим геном. Фибриноген подвергается множественной посттрансляционной модификации: гликозирова нию, фосфорилированию, сульфатированию, гидроксилированию. Дефосфорилированный белок формирует более толстые нити при полимеризации. Фибриноген связывает 3 иона кальция. Молекула фибриногена содержит 4 раздваивающихся углеводные цепи, на концах углеводных цепей могут находиться остатки сиаловых кис лот, играющих важную роль в полимеризации фибрина. При от щеплении сиаловых кислот скорость полимеризации фибрина увеличивается. Увеличение содержания сиаловых кислот при за болеваниях, сопровождающихся повышением активности сиа лилтрансферазы, может считаться одной из причин приобретен ной дисфибриногенемии.

При дисфибриногенемии содержание белка в плазме может быть нормальным, но некоторые его функции нарушены. Извест но более 80 вариантов аминокислотных замен, которые влияют на отщепление фибринопептидов, полимеризацию, взаимодействие с тромбоцитами и эритроцитами, сшивание и разрушение фибрина.

Фибриноген относят к белкам острой фазы воспаления, его уро вень может быть значительно повышен при многих заболеваниях; синтез фибриногена стимулируется интерлейкином 6; его уровень повышается при старении, сердечно сосудистых заболеваниях, ги перлипидемии, курении, приеме пероральных противозачаточных средств. Фибриноген определяет вязкость крови, повышает агрега цию тромбоцитов и эритроцитов, накапливается в области атероскле ротических бляшек, где после превращения в фибрин стабилизирует тромбоцитарные агрегаты. Фибрин и продукты его разрушения стимулируют пролиферацию гладкомышечных клеток и моно цитов, тем самым обеспечивая матрикс для роста клеток и свя зывая тромбин, обладающий митогенной актив ностью.

249

Тема 23. Система свертывания крови

2. Активация свертывания крови. Свертывание крови представ ляет собой каскад реакций, в которых посредством ограниченно го протеолиза образуются активные формы компонентов системы. Многоступенчатость и участие ферментов в реакциях активации обеспечивают резкое усиление начального сигнала и эффектив ного контроля процесса свертывания крови, который протекает в области повреждения сосуда. Два типа взаимодействия могут приводить к инициации свертывания крови, каскад реакций коа гуляции принято представлять в виде двух возможных путей акти вации — внутреннего и внешнего. Для инициации внешнего пути необходим тканевый фактор (тромбопластин), который при нор мальных условиях в крови и клетках, контактирующих с кровью, отсутствует и появляется при повреждении ткани. Внутренний путь, все компоненты которого находятся в крови, начинается с контактной активации фактора XII и прекалликреина.

Внутренний путь. Связывание фактора XII с компонентами субэндотелиального слоя, активированными тромбоцитами, ми целлами фосфолипидов или бактериальными липополисахаридами изменяет его конформацию так, что он становится высокочувстви тельным к протеолитической активации калликреином; в комп лексе с высокомолекулярным кининогеном повышает активацию прекалликреина, который в дальнейшем может обеспечить до полнительную активацию фактора XII. Начальный этап активации фактора XII — расщепление по остатку Arg353 c образованием фер мента, состоящего из 2 полипептидных цепей, соединенных ди сульфидным мостиком. Протеазной активностью обладает легкая цепь, а тяжелая цепь содержит домены, обеспечивающие взаимо действие с другими компонентами. Калликреин плазмы может да

лее расщеплять еще 2 связи по остатками Arg334 и Arg343, что приво дит к образованию β формы фактора XIIа, которая обладает

ферментативной активностью, но в результате потери основной массы тяжелой цепи не способна взаимодействовать с поверх ностью и активировать фактор XI. На следующей стадии фактор XIIа активирует фактор XI, структура которого схожа со структу рой прекалликреина. Высокомолекулярный кининоген служит кофактором активации фактора XI, протекающей на поверхности.

250