Биоорганическая химия. Учебное пособие

Тема 23. Система свертывания крови

Расщепление приводит к образованию фермента, тяжелые цепи ко торого содержат участки, обеспечивающие взаимодействие с высо комолекулярным кининогеном, и необходимы для Са2+ зависимой активации фактора IX.

Активация фактора IX происходит в результате последователь ного расщепления 2 пептидных связей с высвобождением пептида активации и может протекать под действием как фактора XIа, так

икомплекса фактора VII c тканевым фактором в присутствии ио нов кальция. Активация фактора X под действием фактора IХа про текает на поверхности фосфолипидов при участии ионов кальция и фактора VIIIа, выполняющего роль матрицы, обеспечивающей связывание и оптимальное взаимодействие факторов IХа и X, что значительно увеличивает скорость реакции. Активация фактора X происходит после расщепления связи в N концевой части тяже лой цепи с высвобождением пептида активации. Другой важный активатор фактора Х — комплекс тканевый фактор — фактор VIIа.

При контакте крови с клетками, экспрессирующими ткане вый фактор, фактор VII плазмы связывается с высоким сродством с тканевым фактором. Образованный комплекс приводит к воз растанию чувствительности фактора VII к протеолитической ак

тивации, которая заключается в расщеплении связи Arg152–Ile153. Активация может происходить и под действием следов активных

факторов X, XI и в результате аутоактивации.

3.Образование тромбина. Фактор Х, активированный на по верхности фосфолипидов комплексом фактор IХa–VIIIa или комп лексом фактор VIIа — тканевый фактор, образует комплекс с фактором V и протромбином. Тромбин образуется в результате последова тельного расщепления 2 связей в молекуле протромбина. После гидролиза образуется мейзотромбин, в котором 2 половины ис ходной молекулы связаны дисульфидным мостиком. Мейзотром бин имеет протеолитическую активность, сходную с тромбином

иявляется мощным вазоконстриктором, но не обладает прокоа гулянтными активностями тромбина и не инактивируется анти тромбином III. После гидролиза связи Arg271–Thr272 из комплекса

251

Тема 23. Система свертывания крови

высвобождаются N концевой фрагмент активации протромбина 1 + 2, содержащий все регуляторные домены, и молекула α тромби на, состоящая из 2 цепочек, соединенных дисульфидным мости ком. Активный центр и субстратсвязывающий участок находятся в В цепи, состоящей из 259 аминокислотных остатков. После об разования тромбин диссоциирует из протромбиназного комплекса

ипринимает участие в регуляции многих физиологических процес сов. Наиболее известные функции тромбина: прокоагулянтная, ан тикоагулянтная, вазоактивная и митогенная. На завершающей ста дии свертывания крови тромбин обеспечивает превращение фибриногена в фибрин и активирует фактор XIII, стабилизирую щий фибрин. Тромбин также оказывает прокоагулянтное действие, активируя свое образование.

Винициации свертывания крови большое значение имеют по ложительные обратные связи, которые обеспечивают преодоление ингибиторного потенциала крови и образование тромбина в коли честве, достаточном для активации тромбоцитов и образования фибрина. Тромбин может ускорять свое образование, активируя тромбоциты, факторы V и VII, возможно — и факторы VII и IX. Тромбин является наиболее мощным активатором тромбоцитов, этот путь активации тромбоцитов служит основным механизмом образования артериальных тромбов. Активация осуществляется че рез специфический рецептор и заключается в отщеплении тром бином N концевого пептида от внеклеточного участка рецептора. Открывающийся при этом новый N концевой остаток служит свя занным лигандом, который активирует рецептор. Согласно этому механизму тромбин действует каталитически и одна молекула тромбина может активировать много рецепторов. В 2 ключевых реакциях свертывания крови важную роль играют факторы Vа

иVIIIа, обеспечивающие образование на поверхности фосфолипи дов комплексов, в которых каталитическая эффективность реакций активации фактора Х и протромбина увеличивается в сотни тысяч раз. Способность к образованию фосфолипидзависимых комп лексов с соответствующими ферментами и субстратами у факто ров V и VIII появляется после активации тромбином, заключаю щейся в расщеплении как минимум 3 связей. Активация фактора VIII необходима также для его диссоциации из комплекса с фФВ.

252

Тема 24. Система противосвертывания

Кроме тромбина, эти факторы могут активироваться и под дей ствием фактора Ха, но скорость активации меньше, и фактор Ха не может активировать фактор VIII, находящийся в комплексе с фФВ. Основная положительная обратная реакция факторов Ха и IХ — активация фактора VII.

4. Функция фосфолипидов. Наличие многоступенчатого кас када ферментативных реакций может обеспечить значительное усиление начального стимула, необходимое для быстрого тром бирования поврежденных участков сосудов, по которым с высо кой скоростью циркулирует кровь. Но свертывание крови должно быть ограничено участком повреждения стенки сосуда. Локализа ция активации свертывания на поверхности поврежденных или стимулированных клеток — один из таких механизмов ограниче ния. Более того, необходимо участие клеток, экспрессирующих тканевый фактор, и активированных тромбоцитов, на поверхно сти которых могут протекать зависимые от прокоагулянтных фос фолипидов реакции активации свертывания крови. Для мембран клеток характерно асимметричное распределение фосфолипидов: наружный слой мембраны состоит преимущественно из холино вых фосфолипидов, а обладающие прокоагулянтными свойства ми аминофосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтано ламин расположены на цитоплазматической стороне мембраны. Асимметричное распределение фосфолипидов поддерживается АТФ зависимыми транслоказой, перемещающей аминофосфо липиды с наружной стороны мембраны на внутреннюю, и флоп пазой, осуществляющей медленный транспорт аминофосфоли пидов и холиновых фосфолипидов с внутреннего на наружный слой мембраны.

СИСТЕМА ПРОТИВОСВЕРТЫВАНИЯ. ПАТОЛОГИЯ СИСТЕМЫ

Тема 24. ПРОТИВОСВЕРТЫВАНИЯ

1. Факторы противосвертывания. Большинство компонентов системы гемостаза в активированной форме — сериновые протеа зы. Ингибиторы протеаз за исключением ингибитора пути ткане

253

Тема 24. Система противосвертывания

вого фактора (ИПТФ) и α2 макроглобулина — представители од ного семейства, получившего название «серпины» — ингибиторы сериновых протеаз. Серпины состоят из примерно 400 аминокис лотных остатков. Гомология наиболее выражена в С концевой об ласти, содержащей реактивный центр и наименее выражена в N концевой области, легко подвергающейся протеолизу. Механизм действия серпинов заключается в образовании стехиомет риче ского комплекса с протеазой, в котором после расщепления по реактивному центру ингибитор остается связанным ковалентно с серином активного центра фермента. Комплекс протеаза—инги битор выводится из кровотока и разрушается. Локальная инактива ция серпинов путем окисления и отщепления эластазой способст вует ограничению участков воспаления. Системная инактивация является одним из механизмов развития ДВС синдрома при сеп сисе.

Антитромбин III ингибирует все протеазы системы свертывания крови, а также плазмин, трипсин, Cs компонент комплемента; кон центрация антитромбина III в плазме составляет 0,15–0,18 мг/мл, период полувыведения — около 3 дней. Антитромбин III синтези руется клетками паренхимы печени, некоторое его количество — эндотелием. При инфузии антитромбина III восстановление его уровня в плазме происходит медленнее, чем можно ожидать исходя из объема крови и количества введенного белка, так как некоторое количество антитромбина III может депонироваться в тканях. Ан титромбин III состоит из 432 аминокислотных остатков, имеет 3 дисульфидных мостика и 4 участка гликозирования. Реактив ный центр образует пара Arg393–Ser394.

Взаимодействие антитромбина III с тромбином протекает в две стадии. На первой стадии образуется обратимый комплекс, затем происходит расщепление ингибитора и образование ковалентной связи между ферментом и ингибитором. Скорость ингибирования протеаз возрастает в присутствии сульфатированных олигосахаридов (один из них — гепарин). Минимальная структура, обеспечивающая активацию антитромбина III — пентасахарид, содержащий четыре специфически расположенные сульфогруппы, его активирующее действие определяется влиянием на положение петли, содержа

254

Тема 24. Система противосвертывания

щей реактивный центр. В антитромбине III в отличие от неакти вируемых ингибиторов она частично погружена в основную структуру белка и экспонируется наружу после взаимодействия с кофактором. Такая мобильность реактивного центра предохра няет чувствительный участок от неспецифической активации. В физиологических условиях гепарин связывается с антитромби ном III с высоким сродством и стехиометрически. Остатки Arg47,

Lys125, Arg129, Arg132, Lys133 имеют ведущую роль во взаимодей ствии с гепарином; они образуют сферу положительных зарядов

антитромбина III, изменение пространственной локализации ко торых в результате модификации близлежащих аминокислот или расщепления дисфульфидной связи С концевой части молекулы вызывает уменьшение способности связывать гепарин. Специфи ческое связывание гепарина зависит от третичной структуры анти тромбина III. Изменение структуры антитромбина III приводит к значительному увеличению скорости ингибирования тромбина и увеличению сродства к гепарину. После образования комплекса с протеазой и расщепления по реактивному центру происходят новые конформационные изменения антитромбина III, которые приводят уже к снижению его сродства к гепарину. Снижение сродства к гепарину после образования комплекса протеазаанит ромбин III приводит к тому, что в ингибировании протеаз гепарин действует каталитически: после образования комплекса протеа заантитромбин III он может высвобождаться из комплекса и участвовать в новом акте. Снижение сродства к гепарину после образования комплекса протеазаантитромбин III может способст вовать диссоциации комплекса с поверхности эндотелия и удале нию его из крови. Активация антитромбина III за счет пентасаха ридного фрагмента — не единственный механизм, определяющий антикоагулянтное действие гепарина. Высокая скорость ингиби рования тромбина, примерно на порядок превышающая скорость ингибирования фактора Ха, обусловлена тем, что в этой реакции гепарин не только активирует антитромбин III, но и связывается с тромбином, выполняя роль матрицы, обеспечивающей эффек тивное взаимодействие протеазы с ингибитором. Кроме тромби на, это взаимодействие происходит при ингибировании факторов

255

Тема 24. Система противосвертывания

IХа и ХIа, но не имеет существенного значения при ингибирова нии факторов Ха, ХIIа и калликреина. Роль матрицы выполняют только те молекулы гепарина, которые имеют не менее 18 саха ридных остатков.

В кровотоке функцию кофактора антитромбина III выпол няют гликозаминогликаны и гликопротеины эндотелия, имеющие гепариноподобные структуры. На взаимодействие антитромбина III и тромбина с гликопротеинами эндотелия и стенки сосудов ока зывают влияние некоторые белки плазмы. Богатый гистидином гликопротеин, секретируемый из α гранул тромбоцитов фактор IV и витронектин могут связываться с гепариноподобными структура ми и препятствовать инактивации тромбина и фактора Ха. Активи рованные нейтрофилы могут также подавлять антикоагулянтные свойства поверхностных гликопротеинов эндотелия, что является одним из механизмов развития тромбоза при сепсисе. Итак, когда тромбин вымывается потоком крови из места образования и кон тактирует с неповрежденным эндотелием, он может быть нейтрали зован антитромбином III, связанным с гликопротеинами стенки со судов. Этот механизм инактивации тромбина более эффективно действует в микроциркуляции, где соотношение между объемом протекающей крови и поверхностью сосуда значительно выше, чем в магистральных сосудах.

256

Тема 24. Система противосвертывания

Окончание табл. 14

Кофактор II гепарина (ГК II — селективный ингибитор тром бина) относится к семейству серпинов, отличается значительной структурной гомологией с антитромбином III. ГК II имеет меньшее сродство к гепарину, чем антитромбин III, имеет селективность, ингибируя с высокой скоростью только тромбин и медленнее — лейкоцитарный катепсин G. Реактивный центр ГК II представляет пару аминокислот Leu444–Ser445, связь между которыми тромбин (в отличие от катепсина G) в других белках не гидролизует. Высокая специфичность ГК II в ингибировании тромбина может быть об условлена тем, что во взаимодействии с тромбином принимает

257

Тема 24. Система противосвертывания

участие не только реактивный центр ингибитора, но и специфиче ская последовательность кислых аминокислот N концевой части молекулы. Антитромбин III и ГК II могут взаимно дополнять друг друга, контролируя активность тромбина в разных участках сосуда. Антитромбин III обеспечивает нейтрализацию тромбина при участи гепариноподобных структур на поверхности эндоте лия, а ГК II — во внутренней оболочке артерий и средней оболоч ке сосудов.

Протеазный нексин I представляет собой белок, принадле жащий к семейству серпинов, ингибирует протеазы системы фиб ринолиза, ПрС и тромбин. Гепарин увеличивает скорость инги бирования протеаз. Концентрация ПН I в плазме много ниже, чем антитромбина III или ГК II, но его локальная концентрация на тромбоцитах может достигать значений, достаточных для регуля ции активности тромбина и ПрС. В межклеточном пространстве связывание ПН I с белками матрикса повышает его специфич ность как ингибитора тромбина. В наиболее высокой концентра ции ПН I обнаружен в головном мозге в структурах, окружающих кровеносные сосуды и астроциты.

Ингибитор тканевого фактора (ИПТФ) — плазменный белок, при участии которого фактор Ха может ингибировать активацию фактора Х комплексом фактор VIIа—тканевый фактор. ИПТФ синтезируется в клетках эндотелия капилляров и мегакариоцитах, меньшее количество — в моноцитах. В плазме основная часть ИПТФ находится в виде комплекса с липопротеидами (50% его связано с липопротеинами низкой плотности и триглицеридами, примерно такое же количество — с липопротеинами высокой плотности, где он ковалентно связан дисульфидным мостиком с апобелком А II; свободная форма, обладающая наибольшей ан тикоагулянтной активностью составляет только 5–10%). Тромбо циты содержат также некоторое количество ИПНФ, их активация приводит к секреции ингибитора, что может повышать локальную концентрацию ингибитора в зоне тромбообразования. При нару шении липидного обмена концентрация ИПТФ в плазме повыше на, особенно при гиперлипидемии типа II, что связано с перерас пределением ингибитора между эндотелием и липопротеинами. ИПТФ синтезируется как полипептид, состоящий из 276 амино кислотных остатков; он может подвергаться посттрансляционно

258

Тема 24. Система противосвертывания

му N гликозилированию по остаткам аспарагина, сульфатирова нию олигосахаридной цепочки и фосфорилированию. Протеолиз С концевой области ИПТФ приводит к потере его способности взаимодействовать с липопротеинами. Гепарин увеличивает эф фективность ингибирования протеаз; в С концевой части ИПТФ обнаружено 2 участка связывания гепарина. Наибольшим сродст вом обладают молекулы гепарина, имеющие молекулярную массу более 10 кДж и/или высокую плотность зарядов. Каждый из 3 ин гибиторных доменов ИПТФ обладает потенциальным реактив ным центром, находящимся в области жесткой третичной структу ры, поддерживаемой 3 дисульфидными мостиками на протяжении примерно 50 аминокислотных остатков. В отличие от серпинов, ИПТФ не образует ковалентной связи с протеазой и может быть вы теснен из активного центра конкурентным ингибитором. 3 из трех ингибиторных доменов ИПТФ непосредственно участвуют в инги бировании, обладая специфичностью относительно ингибируемой протеазы. Один домен связывается с активным центром фактора VIIа, а второй — фактора Ха. Ингибирование активации сверты вания крови под действием ИПТФ стадийно: вначале ИПТФ об разует обратимый комплекс с фактором Ха, который затем связыва ется с комплексом фактор VIIа—тканевый фактор, как следствие этого образуется 4 компонентный комплекс, стабильность которо го обеспечивается множественными взаимодействиями (ингиби торных доменов с активными центрами, G1a доменов с тканевым фактором, гидрофобных участков с фосфолипидами). Функция ИПТФ состоит в снижении скорости образования факторов IХа, Ха до величины, при которой их активность может контролиро ваться антитромбином III. Антитромбин III и ИПТФ, действуя на разные стадии активации, обеспечивают наличие определенного порога, только после преодоления которого может начаться мас сивная генерация тромбина, необходимого для свертывания крови.

Система протеина С

Протеин С служит проферментом, который после активации тромбином специфически расщепляет факторы Vа и VIIIа, что приводит к прерыванию каскада реакций активации свертывания крови; синтезируется в печени как полипептид, состоящий из 461 аминокислотного остатка; подвергается N гликозированию по 4 участкам, его молекулярная масса составляет 62 кДж. В плазме

259

Тема 24. Система противосвертывания

ПрС находится в 2 цепочной форме, образующейся в результате расщепления связи Arg157–Thr158 в молекуле предшественника и удаления 2 С концевых аминокислот легкой N концевой цепи. ПрС обладает узкой субстратной специфичностью и с высокой скоростью расщепляет только активированные формы факторов Va и VIIIа. Активация ПрС происходит в результате расщепления связи Arg169–Leu170 в N концевой части тяжелой цепи и сопро вождается освобождением пептида активации. Свободный тром бин активирует ПрС с очень низкой скоростью и только в отсут ствии ионов кальция. Эндотелий сосудов в тысячи раз ускоряет активацию ПрС благодаря тромбомодулину, который обеспечи вает активацию ПрС тромбином.

Тромбомодулин (ТМ) — трансмембранный гликопротеин, со стоящий из 557 аминокислотных остатков. ТМ связывает тромбин

свысоким сродством. Связывание тромбина и изменение его суб стратной специфичности обеспечиваются структурами 5 го и 6 го EGF доменов, которые взаимодействуют с субстратсвязываю щим участком активного центра тромбина, и хондроитинсульфат ной цепью, которая связывается с последовательностью щелочных аминокислот тромбина. Две молекулы тромбина связываются

содной молекулой ТМ. Связывание тромбина с ТМ значительно увеличивает каталитическую эффективность реакции активации ПрС и ингибирует прокоагулянтные функции тромбина: актива цию тромбоцитов, фактора V и свертывание фибриногена. Свя зывание с ТМ стимулирует эндоцитоз комплекса и разрушение тромбина лизосомальными ферментами, а также инактивацию тромбина антитромбином III. ТМ экспрессируется в эндотелиаль ных клетках вен, артерий, капилляров и лимфатической системы, но не в головном мозге. Синтез ТМ может стимулироваться тром бином, цАМФ, пентоксифиллином и ИЛ 4; снижается под воз действием эндотоксина, ИЛ 1, TNF, гипоксии.

Протеин S (ПрS) — витамин К зависимый белок, увеличиваю щий скорость активации протеином С факторов Va и VIIIа в со ставе протромбиназного и Ха ного комплексов, причем в присут ствии фосфолипидов. ПрS синтезируется в печени, эндотелии, интерстициальных клетках семенников и мегакариоцитах, секре

260