6 курс / Медицинская реабилитация, ЛФК, Спортивная медицина / Геронтология_in_polemico_Мушкабаров_Н_Н_

390

не простое следствие многоклеточности организма.

II. К тому же, из всего вытекало, что ограниченность делений запрограммирована в геноме клеток, поскольку проявляется, как сказано, лишь по исчерпании вполне определённого лимита.

III. И стало очевидно, что должен существовать внутриклеточный механизм счёта делений. Тот самый, в качестве которого, как теперь принято считать, выступает укорочение хромосомных теломер при каждом делении.

г) Конечно, мир поверил в эффект Хейфлика не сразу. Уж слишком неожиданно всё переворачивалось с ног на голову или наоборот. Но в конце концов перевернулось.

4. Число делений клеток зависит от возраста их донора.

а) Перелому воззрений способствовало то, что Хейфлик получил дополнительные экспериментальные факты, которые с непринуждённой простотой вписывались в его концепцию. И которые, конечно, стали подтверждаться другими исследователями.

б) I. Так, число делений фибробластов человека тем меньше, чем старше субъ-

ект, у которого взяты фибробласты.

II. Фибробласты человеческого эмбриона выдерживают при культивировании ~50 пассажей, фибробласты взрослого человека (тоже в культуре) – меньше, а старого человека – ещё меньше пассажей.

III. Это означает, что счёт делений клетки производится и in vivo, а при переносе клеток in vitro данный счёт продолжается, не прерываясь и не начинаясь заново.

в) I. Конкретно, было установлено, что за год жизни донора среднее количество делений, которое могут совершить его фибробласты при переносе их в культуральные условия, уменьшается на 0,2.

II. Отсюда следует, что весь репликативный потенциал фибробластов может израсходоваться лишь за 250 лет.

г) I. С одной стороны, это внушает восхищение и надежды.

II. А с другой стороны, вызывает недоумение: получается, что данная программа старения так ни у кого и не реализуется. Тогда зачем она создавалась эволюцией?! Это очень серьёзный вопрос, но оставим сомнения на потом.

5. Ещё пара неплохих фактов.

А пока приведём ещё пару фактов, органично дополняющих концепцию.

а) I. Память о счёте сохраняется даже при очень длительном замораживании (в присутствии антифриза) – вплоть до нескольких десятков лет.

II. После размораживания клетки возобновляют деления и делятся ровно столько раз, сколько им оставалось делиться до замораживания.

III. Если бы память не сохранялась, это бы никак не отрицало эффекта Хейфлика. Но то, что после размораживания счёт возобновляется с прежнего числа, придаёт эффекту блеск и фундаментальность.

б) I. Очень демонстративно также то, что количество делений фибробластов, взятых у эмбрионов или у новорождённых разных животных, положительно коррелирует с максимальной видовой ПЖо этих животных (табл. 3.1).

Таблица 3.1. Лимит Хейфлика для разных животных

391

II. Конечно, понятие max-ПЖо – ещё довольно расплывчато и трактуется всеми по-разному (см. п. 1.4.2.2). Тем не менее, выглядит таблица весьма убедительно.

6. Возвращение к Вейсману.

Таким образом, Хейфлик вернул мир почти к тому, что утверждал А.Вейсман:

-количество делений соматических клеток – ограничено,

-ограниченность числа делений обусловлена генетической программой, выработанной в ходе эволюции,

-в линии половых клеток программа старения не реализуется.

Собственно, последний тезис не обсуждался ни Каррелем, ни Хейфликом, а так

ипереходил из эпохи в эпоху как самоочевидная вещь.

3.1.1.4.Эпоха стволовых клеток: «компромисс Карреля-Хейфлика»

1. Поправка к Хейфлику.

а) Но в последние полтора–два десятилетия, не отвергая Хейфлика, его чутьчуть подправили. Оказывается, лимит делений имеется не у всех соматических клеток: его нет у стволовых клеток.

б) Как я уже не однажды упоминал (напр., в п. 1.3.6.3 и п. 2.6.5.3), ныне крайне популярно представление, что в организме имеются такие чудесные стволовые клетки (СК), которые

-могут делиться неограниченное число раз,

-не стареют и

-способны дифференцироваться в клетки любой ткани.

2. Поправка к Каррелю.

а) I. Конечно, это не вполне совпадает со взглядами эпохи Карреля, когда считали, что все митотически делящиеся клетки вне организма, в принципе, не стареют.

II. Сейчас это относят только к СК.

III. Но для учёной общественности и широкой публики – радость та же: есть всётаки что-то совсем нестареющее!

б) Да, к тому же, оказывается, это не только какие-то особенные, как вещь в себе, герминативные клетки, которые ни во что иное, как в сперматозоиды или яйцеклетки, превратиться не могут.

А и, так сказать, «хорошие бесстрашные парни из службы спасения», готовые помочь в любой ситуации.

в) Помимо того, клетки Карреля не старели только вне организма, а СК, по распространённому убеждению, не стареют и в культуре, и в организме.

г) Так что ситуация с возможным омоложением человека оказывается даже более оптимистичной, нежели во времена Карреля.

3. Формула компромисса.

Итак, многие считают, что из соматических клеток

-стволовые – делятся бесконечно,

-все остальные клетки человека делятся не более 50 раз.

Я бы назвал это представление «компромиссом Карреля-Хейфлика».

3.1.1.5. Бессмертны ли СК, или что остаётся от Карреля?

По поводу первого тезиса я уже высказывался в п. 1.3.6.3. Сейчас в отношении него же обращу внимание на следующее.

1. СК – различны.

а) В последние годы появляется всё больше данных о том, что СК весьма раз-

392

личны по уровню своих стволовых свойств (перечисленных выше): среди них есть «более стволовые» и «менее стволовые».

б) Вторые (как скажем, гемопоэтические СК; п. 2.6.5.3)

-и не столь уж тотипотентны,

-и, оказывается, даже стареют,

-а потому и делятся, надо понимать, не бесконечно.

2. Свойства СК зависят от возраста донора.

а) А все вместе СК, по некоторым данным, укладываются в закономерность: они

-тем «круче», т.е. тем более проявляют свои стволовые свойства,

-чем моложе организм, из которого они взяты.

б) Так, СК из пуповинной крови новорождённого (СКПК) более эффективны, чем СК крови (СКК) взрослого человека.

А лучше всего СК, полученные от зародыша на стадии бластулы (т.н. эмбриональные СК, ЭСК, из эмбриобласта бластоцисты).

в) Очевидно, такая закономерность однозначно свидетельствует о том, что все СК в организме всё-таки стареют: чем старше донор СК, тем ограниченней возможности этих СК.

3. Бессмертна ли культура ЭСК?

а) Правда, те же ЭСК в культуре проходят более 100 делений и признаются бессмертными.

б) Ну, тут можно сказать следующее:

-высокий репродуктивный потенциал ЭСК, в принципе, не удивителен, учитывая стадию забора этих клеток;

-но даже после 100 делений вряд ли можно делать вывод о бессмертии культуры,

-кроме того, не исключена ошибка «а ля Каррель» (п. 3.1.1.3).

3.1.1.6. А есть ли лимит, или что остаётся от Хейфлика?

Ещё больше сомнений вызывает второй тезис «компромисса КарреляХейфлика» – о всеобщем лимите в 50 делений.

1. От какой печки отсчёт?

Прежде всего, неясно, к чему всё-таки относится данный лимит?

а) Допустим, в соответствии с компромиссом, деления стволовых клеток мы не учитываем. И делаем такую же попытку, какую предпринимали в п. 2.6.5.3, т.е. собираемся начать счёт с первого дифференцировочного деления, приведшего к коммитированию (сужению множества потенциальных направлений развития клетки), а значит, и к началу дифференцировки.

б) Но стволовые клетки, как уже сказано, – разные: с возрастом остаются всё более коммитированные СК.

в) Исчезновение клеток со свойствами ЭСК – это проявление старения. Но само превращение ЭСК в ГСК (эмбриональной СК в гемопоэтическую) представляет собой именно коммитирование и начало дифференцировки.

г) С каких же СК нам и клеткам следует начинать отсчёт лимитированных делений: с зиготы, с ЭСК, с СКПК, с СКК, с ГСК? Нет ответа...

2. Если СК не стареют, то лимит Хэйфлика не влияет на ПЖо.

а) Вдумайтесь в следующее.

Ещё важнее то, что дифференцировочные деления, если они отсчитываются от некой популяции СК, существующей на протяжении всего онтогенеза, могут лишь отражать (частотой инициации, частотой чередования, продолжительностью одного де-

393

ления и их общим количеством) возраст быстро обновляемой ткани.

Но они не могут и не должны (по крайней мере, сами по себе) определять этот возраст.

б) Онтогенез, самоподдержание СК и старение – «горизонтальны», дифференцировка – «вертикальна».

В самом деле, условно говоря,

-воспроизведение стволовых клеток в течение онтогенеза можно рассматривать как «горизонтальный» процесс, направленный вдоль оси онтогенеза,

-а регулярное вступление части стволовых клеток в дифференцировку – как относительно короткие вертикали, отходящие от длинной «горизонтали».

в) Лимитирование «вертикали» не влияет на старение.

Можно, конечно, допустить, как мы уже дважды делали, что лимит относится к «вертикалям»: в «вертикали» не может быть более 50-60 делений.

I. Но, во-первых, расчёты для эритропоэза показали маловероятность таких длинных «вертикалей» (п. 2.6.5.5).

II. А во-вторых, если бы даже деления в «вертикалях» и доходили до предела Хейфлика и, в связи с этим, конечные клетки погибали (как те же роговые чешуйки эпидермиса), то это означало бы просто терминальную дифференцировку, но не старение ткани.

г) Если «горизонтальная жизнь» СК не лимитирована, Хейфлик не важен.

I. Старением же являлась бы лишь постепенная убыль стволовых клеток.

II. Но если, как предусматривает «компромисс Карелля-Хейфлика», стволовые клетки не стареют, то не стареют и все быстро обновляющиеся ткани.

Конечно, так многие и считают.

III. Однако в этом случае лимит Хейфлика остаётся совершенно не при деле.

Т.е. «компромисс Карреля-Хейфлика» означает лишение лимита Хейфлика

какой-либо роли в старении организма.

3. Лимитирование суммы делений «горизонтали» и «вертикали».

а) Единственная возможность.

I. Чтобы придать смысл лимиту Хейфлика, надо

-отказаться от идеи о безлимитности делений стволовых клеток

-и предположить, что лимитируется сумма предшествующих делений СК и дифференцировочных делений созревающих клеток.

II. Из расчётов в п. 2.6.5.5 было видно, что это, в принципе, возможно, хотя и маловероятно.

б) И всё же это более, чем сомнительно. Мешает теломераза.

Положение осложняется следующим обстоятельством.

I. Лимит Хейфлика обычно объясняют отсутствием в соответствующих клетках фермента теломеразы, из-за чего при каждом делении немного укорачиваются теломеры хромосом. Гибель линии наступает, когда укорочение начинает затрагивать значащие области генома.

II. Но оказывается, что далеко не все делящиеся соматические клетки полностью лишены теломеразы: последняя с разной долей вероятности обнаруживается в клет-

ках многих органов и тканей (например, в лимфоцитах, в эпидермисе, эндометрии и т.д.).

III. Конечно, возможно, теломераза сосредоточена преимущественно в камбиальных (стволовых) клетках (хотя лимфоциты трудно назвать таковыми).

IV. Но всё равно получается, что в разных линиях СК и в отходящих от них «вертикалях» (дифферонах) деления будут по-разному влиять на состояние теломер. И надеяться на существование единого лимита делений для всех – просто наивно.

394

4. А что с фибробластами?

Наконец, вставим в строку и то сомнение, которое уже прозвучало в п. 3.1.1.3 в отношении классических результатов Хейфлика для фибробластов человека.

а) Я имею в виду то обстоятельство, что к 90 годам жизни репликативный потенциал фибробластов расходуется всего на 40% (уменьшается на 20 делений из 50 максимально возможных для эмбриональных макрофагов).

б) Отсюда вытекает, что, по крайней мере, у человека влияния на жизнеспособность и продолжительность делений клеток эффект Хейфлика не оказывает.

5. Итоги.

а) Итак, в конце п. 3.1.1.4 мы сформулировали простой и очевидный для многих компромисс между представлениями Карреля и Хейфлика: из соматических клеток

-стволовые – делятся бесконечно,

-все остальные клетки человека делятся не более 50 раз.

б) Последующий анализ показал, что такой компромисс на самом деле практически невозможен.

I. Первый тезис маловероятен сам по себе и, к тому же, в случае реализации, лишал бы смысла второй тезис.

II. И второй тезис, помимо несовместимости с первым, тоже маловероятен.

в) Поэтому указанный компромисс, как я полагаю, должен быть заменён на соответствующие положения концепции «АНЕРЕМ»:

-стволовые клетки с большей или меньшей скоростью, но стареют;

-какого-то одного лимита делений, универсального для всех делящихся клеток человека, не существует.

3.1.2. КЛУБОК ИДЕЙ – ВЕРНЫХ И СОМНИТЕЛЬНЫХ (типичные представления о теломерах и их роли в старении)

3.1.2.1.Введение

1.а) Как бы мы ни подвергали сомнению роль эффекта Хейфлика в старении, сам факт существования этого эффекта отрицать у нас нет никаких оснований.

б) Суть его, напомню, состоит в том, что в культуре фибробласты делятся ограниченное число раз, например у человека – не более 50 раз.

Именно, подчёркиваю, в культуре и именно фибробласты.

2.а) Принято считать, что счётчиком делений фибробластов (да и других клеток) является механизм, связанный с укорочением теломер.

Последнее же происходит при репликации (удвоениии) ДНК в отсутствие (или при недостаточной активности) теломеразы.

б) Это выглядит достаточно убедительным и обоснованным – но только в нулевом приближении.

При более же внимательном взгляде, при учёте некоторых «тонких» обстоятельств, у меня возникают определённые сомнения относительно этого, казалось бы, давно выясненного вопроса.

Да и некоторые другие факты тоже не вполне согласуются с принятой версией.

3.Однако на той же почве буйным цветом расцвели и совсем ложные идеи. Главная из них – крайне популярная, но при том и крайне примитивная сентен-

ция, по которой весь механизм старения сводится к укорочению теломер в делящихся клетках.

4. Рассмотрим всё это по порядку.

396

ДНК, поскольку 5´-конец крайнего фрагмента цепи удлиняться не может.

II. Очевидно, что такая коллизия возникает только для линейных ДНК.

б) В итоге, после удаления РНК-затравки 5´-конец дочерней цепи оказывается укороченным:

в) Причём, ферментный комплекс, удаляющий РНК-затравку, отрезает не только её, но и (чтоб «не показалось» мало!) ближайший кусок той же цепи ДНК, – всего около 50–65 нуклеотидов.

5. Укорочение теломер хроматиды.

а) В отсутствие теломеразы (а о механизме её действия мы скажем позже), так вот, в отсутствие теломеразы

-5´-конец каждой дочерней цепи имеет заметный изъян,

-и, соответственно, 3´-конец родительской цепи на протяжении этого «изъяна» остаётся неспаренным, и такие концы двухцепочечной в прочих отделах ДНК называ-

ются «липкими», «острыми», или «оверхенгами».

б) Но при сохранении таких «липких» концов ДНК могла бы участвовать в нежелательных взаимодействиях с какими-то иными молекулами ДНК, имеющими оверхенг, комплементарный первому.

в) Во избежание этого, «острые» концы быстро «затупляются» – «отстригаются» нуклеазами.

В результате, теперь уже обе цепи молекулы ДНК оказываются укороченными на 50–65 нукл.. пар.

г) I. Но, как известно, каждая внутриядерная молекула ДНК, в комплексе с соответствующими белками, в меньшей или в большей степени конденсируется (становится более компактной) и образует одну хроматиду (в двухроматидной хромосоме).

II. Поэтому укорочение молекулы ДНК с одного из её концов означает, что с этой сторон укорачивается теломера хроматиды.

3.1.2.3.Что сделал первооткрыватель – А.М. Оловников

1.Исходные данные.

а) В 1971 году ничего не было известно об укорочении ДНК при репликации. Но был достаточно хорошо выяснен механизм действия репликативного ферментного комплекса, в т.ч.

-использование РНК-затравок,

-строгая однонаправленность удлинения полинуклеотидной цепи,

-пофрагментный принцип репликации.

б) Проанализировав эти факты, А.М. Оловников пришёл к заключению, что че- го-то не хватает. А именно, не видно, каким способом всё же реплицируется 3´-конец матричной цепи, с которым вначале связывается РНК-затравка.

2. Гипотеза-минимум.

а) I. В принципе, на это можно было не обратить серьёзного внимания.

II. Ну, в лучшем случае, указать, что вот есть такая небольшая проблема и надо поискать какой-то дополнительный фермент.

б) Наличие фермента А.М. Оловников, разумеется, предсказал. И, хотя мало кто ему поверил, в середине 80-х годов прошлого века, т.е. через 15 лет после предсказания, последнее с блеском подтвердилось – была открыта теломераза.

397

3. Дополнительные предпосылки.

а) Но одним сравнительно скромным предсказанием Оловников не ограничился. Он в своей гипотезе придал обнаруженной проблеме воистину общебиологический масштаб.

б) В те времена мир только успел поверить в удивительные данные Л.Хейфлика (об ограниченности делений клеток в культуре) и пытался их как-то объяснить.

в) I. Вместе с тем, тогда была популярна т.н. теория «билетиков». Она касалась счёта числа трансляций мРНК.

II. Было известно, что многие мРНК используются в трансляции рибосомами не один раз, а около 15–20 раз.

III. Так вот, считалось (и, похоже, вполне справедливо), что при каждой трансляции мРНК от её полиА-последовательности на 3´-конце специальной нуклеазой отщепляется по 10–15 нуклеотидов.

IV. Когда такие «билетики» кончаются (а всего в полиА-фрагменте – 200 нуклеотидов), мРНК становится доступной для РНКазы и разрушается.

4. Что было бы самым очевидным?

а) На фоне всех этих идей и обстоятельств, А.М.Оловников не пошёл по самому очевидному пути.

б) А самым очевидным было бы считать, что неизвестный фермент есть во всех клетках, просто он пока не обнаружен.

в) Ну а раз он есть везде, то везде ДНК реплицируется полностью – и, собственно... собственно говоря, больше ничего интересного.

5.Гипотеза-максимум: без теломеразы – счёт делений, наличие старения и предела делений.

а) Однако, насколько я понимаю, мысли А.М.Оловникова были заняты эффектом Хейфлика. И вот тут всё сразу сошлось одно к одному.

Совсем не надо, чтобы тот самый фермент присутствовал во всех клетках!

б) I. Пусть в обычных митотических клетках его нет. Тогда получается, что при каждом делении клетки хромосомы тоже теряют «билетики», отрываемые от теломер.

II. И так же, как с мРНК, этот процесс ограничен длиной «транспортной ленты». III. А когда «лента» кончается, клетки погибают. Что и происходит в культурах

Хейфлика при исчерпании лимита делений и обозначается как клеточное старение.

в) Следовательно, счёт числа делений клеток осуществляется путём укорочения теломер хромосом. И одновременно это есть механизм старения.

г) Так что, действительно не надо, чтобы во всех клетках присутствовала теломераза. Тогда объясняется одно из общебиологических явлений – старение.

6.Гипотеза-максимум: с теломеразой – гаметогенез и онкогенез.

а) А с теломеразой свяжем ещё пару феноменов того же масштаба: наличие теломеразы – обязательное условие

-развития половых клеток (чтобы передавать потомству хромосомы нормальной

длины)

-и опухолевого роста (для обеспечения нелимитированного числа делений).

б) Таким образом, все мировые проблемы, в принципе, благополучно решены.

7. Реплика.

а) Не знаю, считал ли так в 1971 году сам создатель этих представлений. Думаю, у него было всё же достаточно здравого смысла.

б) Но когда в конце 90-х годов ХХ-го века начался теломеразный бум, тут уже многим здравого смысла не хватило. И это состояние у иных не проходит и поныне.

в) А вот, как выглядит при более внимательном рассмотрении, например, идея о

399

шившейся поэтому теломеразы.

3. Накопление укорочений в теломерах.

а) Результат первой репликации нам известен: в хромосоме А одной дочерней клетки на один «билетик» укорочена теломера №1, а в такой же хромосоме другой клетки укорочена теломера №2.

б) В ходе второй репликации образуется уже четыре «внучатые» хромосомы А:

-одна – с укороченной дважды теломерой №1 и интактной теломерой №2,

-две – где каждая их теломер (№1 и №2) укорочена на один «билетик»,

-и ещё одна, в которой – интактна теломера 1 и дважды укорочена теломера №2.

в) В итоге, после n клеточных делений вероятность k укорочений какой-либо одной из двух теломер (например, теломеры №1) в множестве «потомков» этой хромосомы описывается биномиальным законом (см. ссылку 32, с. 86, с учётом равновероятности укорочения теломер):

4. Накопление укорочений: n = 10.

Так, после 10 делений «потомками» одной хромосомы будут 2n =1024 хромосом в таком же количестве клеток.

Это означает, что при образовании примерно одной из этих хромосом в ходе всех десяти репликаций ни разу не произошло укорочение теломеры №1, но зато все 10 раз укорачивалась теломера №2.

II. В силу симметрии, должна быть и такая хромосома (для неё k=10), у которой, наоборот, 10 раз укорачивалась теломера №1 и ни разу не укорачивалась теломера №2.

б) А теперь подставим k=5 (при том же значении n=10):

Такова вероятность того, что за 10 делений теломера 1 будет укорочена 5 раз. И, очевидно, таким же будет укорочение теломеры №2 (поскольку n – k = k).

5. Образуется распределение.

Эти, столь незамысловато полученные, результаты означают следующее.

а) Хромосомы укорачиваются после серии клеточных делений не одинаково, как принято считать, а по-разному.

б) Если отсчитывать поколения клеток от одной исходной клетки с совершенно целыми теломерами и полностью лишённой (как и последующие клетки) теломеразы,

- то совокупность всех тех хромосом клеток n-ного поколения, которые произошли из одной и той же хромосомы, образует распределение, становящееся с каждым митозом всё более широким и уплощённым.

6. Минимумы и максимум распределения при n = 10.

а) Так, после 10 делений в любом подобном множестве («клоне») хромосом

-с вероятностью по ~0,1% присутствуют хромосомы, у которых одна из теломер осталась целой, а вторая претерпела 10 укорочений;

-с несколько большей вероятностью – хромосомы с 1-кратным укорочением одной теломеры и 9-кратным укорочением другой теломеры;

-и так далее...;