1 курс / Химия / Uchebnik_Osnovy_analiticheskoy_khimii

Каждый пик имеет ряд численных характеристик (параметров), которые измеряют на хроматограмме или рассчитывают по непосредственно измеренным величинам. Первая группа параметров (характеристики удерживания) характеризует положение пика, они зависят не от концентрации компонентов, а от их природы:

tR – время от момента ввода пробы до прохождения компонента через детектор. Эту величину называют измеренным временем удерживания. На хроматограмме ему соответствует расстояние lR (в миллиметрах или сантиметрах) – от начала записи данной хроматограммы до абсциссы максимума пика. Величина tR складывается из двух составляющих: времени пребывания компонента в подвижной

фазе (t0) и времени пребывания в неподвижной фазе ( t ). Значение t0

R

невелико, его определяют по времени прохождения через колонку несорбируемого компонента пробы или чистого газа-носителя;

ная величина вычисляется как отношение исправленных времен удерживания данного пика и некоторого другого вещества, условно принятого в качестве стандарта.

Исправленные времена удерживания лучше воспроизводимы, чем tR, и точнее характеризуют компоненты пробы. Преимущество относительных времен удерживания – то, что они практически не зависят от скорости движения газа-носителя, а потому позволяют более надежно идентифицировать компоненты. Еще лучше применять для этой цели логарифмические индексы удерживания (индексы Ковача). Этот способ используется в качественном анализе объектов окружающей среды и в анализе нефтепродуктов (обычно при изотермических разделениях). Индекс Ix характеризует удерживание вещества Х в данной колонке при некоторой постоянной температуре. Положение пика Х на полученной хроматограмме сравнивают с положением пиков двух предельных углеводородов нормального строения (н-алканов). Имеются в виду специально добавляемые в

491

пробу в качестве стандартных веществ н-алканы, между пиками которых находится пик Х. Индексы удерживания н-алканов считают равными числу углеродных атомов в их молекулах, умноженному на 100, т. е. индекс удерживания метана равен 100, этана – 200, пропана

– 300, н-бутана – 400 и т. д. Положение пиков всех остальных соединений определяют именно в этой шкале. Значение индекса Ковача рассчитывают методом линейной интерполяции по логарифмам исправленных времен удерживания. При этом используют формулу:

алканов, молекулы которых содержат n и n+1 атомов углерода, а t' R ( x ) – исправленное время удерживания Х. Отметим, что при по-

вторном вводе пробы (даже на другом хроматографе) значения индексов воспроизводятся с точностью до десятых долей единицы. Индексы Ковача почти не меняются с изменением температуры и скорости газа-носителя, но сильно меняются при переходе к другим неподвижным фазам.

Другая группа параметров описывает форму и площадь единичного хроматографического пика (рис. 7.10). Это высота пика (h), ширина пика у основания (μ), ширина на половине высоты (полуширина, μ0,5 ), площадь (S). Площади пиков обычно измеряют электронным интегратором. Если пик симметричен, можно приближенно оценить его площадь и без интегратора, вручную, – как произведение высоты пика на его полуширину.

Третья группа параметров описывает степень наложения двух соседних пиков на хроматограмме. Наиболее важный параметр – разрешение RS. Тот же параметр иногда называют критерием разделения. Его вычисляют по формуле:

Разрешение пиков считается допустимым, если RS > 1, и достаточно полным, если RS > 1,5. Разрешение тем выше, чем длиннее колонка (см. раздел 7.9).

492

7.8. Способы качественного и количественного хроматографического анализа

Во всех вариантах колоночной хроматографии (ГЖХ, ВЭЖХ, ГАХ, ИОХ и т. п.) используют практически одни и те же способы качественного, а также количественного анализа сложных смесей. Это объясняется тем, что анализ проводится по хроматограмме пробы, а хроматограммы, получаемые во всех этих методах, однотипны. Рассмотрим способы проведения качественного и количественного анализа на примере самого распространенного метода – газожидкостной хроматографии.

Качественный анализ. На хроматограмме пробы сложного состава можно увидеть десятки и даже сотни пиков. Разобраться, какое именно химическое соединение соответствует тому или иному пику, довольно трудно, а ошибка может привести к опасным последствиям. Для расшифровки хроматограмм можно использовать характеристики удерживания предполагаемых компонентов, это самый простой, хотя и не самый надежный способ. Известно, что характеристики удерживания для данной методики хроматографирования определяются только природой компонента (его температурой кипения, молекулярной массой, наличием определенных функциональных групп в молекуле и др.). Характеристики удерживания весьма специфичны, они могут различаться даже у ближайших изомеров. Именно поэтому хроматографисты используют характеристики удерживания в качестве идентификационных признаков.

Как было показано в разделе 7.7, для каждого пика на хроматограмме можно определить несколько разных характеристик удерживания. Вывод о возможном присутствии некоторого вещества в пробе делают, если какой-либо пик на хроматограмме пробы совпадает по своим характеристикам удерживания с пиком соответствующего чистого вещества. При этом хроматограммы пробы и чистого вещества (или модельной смеси известного состава) должны быть получены в идентичных условиях (тот же хроматограф, колонка, температура, скорость движения газа и т. п.). Теоретически все характеристики удерживания не зависят ни от объема пробы, введенной в хроматограф, ни от концентрации компонента в пробе, ни от концентрации других компонентов. Точность измерения разных характеристик удерживания для одной и той же хроматограммы существенно различается. Идентификацию рекомендуется проводить по индексам Ковача. Надежность результатов качественного анализа в этом слу-

493

чае будет гораздо выше, чем при использовании других характеристик.

Пример 7.4. На хроматограмме бензина исправленное время удерживания некоторого пика – 189 секунд. Этот пик лежит между пиками н-гептана и н-октана, которые, соответственно, характеризуются значениями t' R ( 7 ) и t' R ( 8 ) , равными 172 и 218 секунд. Предполагается,

что неидентифицированный пик принадлежит 2,2,4-триметилпентану. Для этого соединения табличное значение индекса Ковача равно 739,0 (для той же НЖФ и в тех же условиях разделения). Можно ли считать данный пик принадлежащим 2,2,4-триметилпентану?

Решение. Подстановка в формулу (7.16) данных из условия приводит к значению индекса:

Полученное значение почти не отличается от табличного (различие в 0,2 единицы лежит в пределах погрешности измерения индексов). Следовательно, данный пик вполне может принадлежать 2,2,4-триметил- пентану.

Пики считают несовпадающими, если различие между их характеристиками удерживания превышает заранее известную случайную погрешность измерения данной характеристики. Например, если при однократном хроматографировании абсолютное время удерживания эталонного бензола (τэ) 137 секунд, а некоторый пик на хроматограмме пробы имеет время удерживания (τх) 139 секунд, то не ясно, можно ли считать эти пики совпадающими. Но если заранее известно, что времена удерживания на данном приборе измеряются с точностью до 0,1 секунды, то следует считать эти пики несовпадающими, а значит, относящимися к разным веществам. В сомнительных случаях можно использовать известный алгоритм сравнения средних значений случайных величин (t-критерий). Можно также рассчитать доверительные интервалы для обеих сопоставляемых характеристик. Если эти интервалы перекрываются, пики следует считать совпадающими.

Хорошим способом проверки присутствия некоторого вещества в пробе является следующий прием: пробу хроматографируют два раза, первый раз без добавки, а второй раз с добавкой вещества, присутствие которого в пробе проверяется. Если на второй хроматограмме

494

окажется столько же пиков, сколько на первой, причем один из пиков заметно увеличится по высоте и площади, это укажет на присутствие проверяемого вещества в пробе (или другого, но с тем же временем удерживания!). Такой прием позволяет устранить влияние колебаний температуры и скорости газа-носителя, а также влияние случайных погрешностей измерения характеристик удерживания.

Иногда состав пробы совершенно неизвестен, и не ясно, с какими эталонами надо сопоставлять хроматограмму этой пробы. В лаборатории может не оказаться эталонных веществ – предполагаемых компонентов пробы. Полный набор эталонов не может иметь ни одна лаборатория – число известных химических соединений слишком велико! В обоих случаях ни один из вышеперечисленных способов качественного хроматографического анализа реализовать не удастся. Выходом из положения может быть использование табличных значений характеристик удерживания. Начиная с 70-х гг. XX века хроматографисты собирают данные по характеристикам хроматографического удерживания разных веществ на наиболее известных неподвижных фазах (имеются таблицы, справочники, атласы, компьютерные базы данных). Существуют также небольшие базы данных (БД) по характеристикам удерживания однотипных объектов, в частности, пестицидов, наркотиков, углеводородов; их применяют для расшифровки качественного состава соответствующих проб. Для анализа проб неизвестного состава создаются универсальные банки данных, содержащие информацию по десяткам и даже сотням тысяч органических веществ. Естественно, просмотр больших БД требует применения быстродействующих компьютеров и специального программного обеспечения. Надежность идентификации по табличным данным ограничена неполнотой справочных данных – в пробе всегда могут оказаться вещества, сведения о которых отсутствуют в используемой БД.

Часто характеристика удерживания некоторого органического вещества отсутствует в БД, но известны значения аналогичных характеристик других соединений (особенно гомологов) при том же режиме хроматографирования. В таких случаях неизвестную характеристику находят методом интерполяции. Например, строят графическую зависимость логарифма удерживаемого объема от числа атомов углерода в молекуле. Эта зависимость для ряда гомологов линейна, что позволяет прогнозировать удерживаемый объем (или другие характеристики) недостаточно изученного соединения. Сущест-

495

вуют и другие способы прогнозирования (по температурам кипения и т. п.). Значения характеристик, найденные расчетным путем, используют для предположительного отнесения пиков на хроматограмме пробы.

Разные по своей структуре вещества могут случайно совпадать по характеристикам удерживания. Поэтому идентификация компонентов пробы неизвестного состава на основе единичного совпадения характеристик удерживания малонадежна. Зато отрицательный результат такой проверки надежно доказывает, что предполагаемого вещества в пробе на самом деле нет.

Чтобы повысить достоверность идентификации, следует проверять совпадение характеристик удерживания в нескольких разных режимах разделения (разные НЖФ, разные температуры колонки и др.). Если характеристики пиков пробы и эталона снова и снова будут совпадать между собой, то это не может быть случайностью. Такой результат позволит с уверенностью считать проверяемое вещество действительно присутствующим в пробе.

Надежность идентификации может быть дополнительно повышена, если проводить предварительную химическую обработку пробы какими-либо реагентами. Так, пики, исчезающие после обработки смеси органических веществ бромом или перманганатом, обычно принадлежат непредельным соединениям. Еще выше будет надежность отнесения пиков, если использовать селективные детекторы. Например, на хроматограмме некоторой сложной смеси, записанной с применением катарометра, можно увидеть сотню хроматографических пиков. Довольно трудно определить, какие из них принадлежат предельным углеводородам, какие – ароматическим углеводородам, а какие – хлорпроизводным углеводородов. Но можно записать хроматограмму той же смеси с помощью детектора электронного захвата (ДЭЗ). Так как на углеводороды ДЭЗ не реагирует, на новой хроматограмме будут видны лишь немногие пики, принадлежащие хлорпроизводным. А на хроматограмме, записанной с применением фотоионизационного или спектрофотометрического детектора, будут видны только пики ароматических соединений. Очевидно, пики, зафиксированные катарометром на первой хроматограмме, но не зафиксированные ни тем, ни другим селективным детектором, принадлежат предельным углеводородам.

Некоторые детекторы позволяют зарегистрировать спектр компонента пробы в момент его выхода из колонки (ИК-спектр,

496

спектр люминесценции, масс-спектр и др.). Затем с помощью компьютера каждый полученный спектр сопоставляется с эталонными спектрами предполагаемых компонентов пробы. Одновременное совпадение по характеристикам удерживания и по спектрам позволяет абсолютно надежно идентифицировать известные вещества.

Количественный анализ. Пределы обнаружения и нижние границы определяемых концентраций в хроматографическом анализе целиком зависят от используемого детектора. Так, применяя катарометр, можно достаточно точно определять компоненты пробы при их содержании на уровне 0,1 % и более. При использовании ДИП эта граница снижается до 10–4 %. Она может быть снижена и далее – путем перехода к еще более чувствительным детекторам. Однако непосредственно измеряемая детектором физическая величина (отклик детектора) в хроматографическом анализе не является аналитическим сигналом, по которому рассчитывают содержание того или иного компонента. Таким сигналом обычно служит площадь пика (S) на хроматограмме. В качестве аналитического сигнала можно использовать и высоту пика. Какой вариант расчета концентраций (по площадям или по высотам) приведет к более точным результатам анализа, зависит от типа используемого детектора и вида хроматограммы. Изредка в качестве вторичного аналитического сигнала применяют другие характеристики, например, произведение высоты пика на его время удерживания.

Наиболее распространенные методы количественного хроматографического анализа предполагают выполнение следующих условий:

при вводе в хроматограф всех анализируемых проб и эталонов известного состава режим работы хроматографа не меняется. Во всех случаях вводится один и тот же объем пробы;

при вводе и испарении пробы, а также при ее разделении в колонке вещество Х не вступает в какие-либо химические реакции и полностью доходит до детектора;

хроматограмма записывается с помощью дифференциального детектора, отклик которого прямо пропорционален концентрации

Х(обычно это бывает при достаточно низком содержании Х);

пик Х не накладывается на пики других компонентов.

При одновременном выполнении всех перечисленных требований площадь пика можно связать с массой определяемого вещества (mх) и с его концентрацией (Cх) в пробе:

497

Зависимость (7.18) позволяет рассчитывать концентрацию Х в анализируемых пробах теми же способами, что и в других инструментальных методах количественного анализа, а именно: путем сравнения с эталоном, по градуировочному графику, с применением известных добавок Х. Обобщенное название всех вариантов количественного хроматографического анализа, непосредственно основан-

ных на соотношении (7.18) – метод абсолютной калибровки. Напри-

мер, в ходе анализа в хроматограф вводят одинаковые объемы пробы и эталонного раствора Х, получают в строго одинаковых условиях две хроматограммы, измеряют на них площади пиков, создаваемых веществом Х (Sх и Sос) и рассчитывают концентрацию Х в пробе по формуле:

Здесь Сос – концентрация вещества Х в образце сравнения (эталонном растворе). На практике чаще используют другой вариант метода абсолютной калибровки, когда массу или концентрацию Х рассчитывают с применением заранее найденных калибровочных коэффициентов.

Дважды ввести в испаритель совершенно одинаковые объемы раствора с помощью шприца очень трудно, а при несовпадении объемов пробы и образца сравнения расчет по формуле (7.19) приведет к неверным результатам анализа. Поэтому метод абсолютной калибровки хроматографисты применяют редко. Этот метод дает точные результаты лишь при работе на автоматизированных приборах, где проба вводится в испаритель с помощью высокоточных крановдозаторов.

На любых хроматографах хорошие результаты количественно-

го анализа можно получить по методу внутреннего стандарта. В

этом методе от абсолютных значений аналитического сигнала (высоты или площади пика) переходят к нормированным сигналам, а именно к относительным площадям (или относительным высотам) хроматографических пиков. Для этого измеренную площадь пика Х делят на площадь пика вещества Y на той же хроматограмме. Вещество Y называют внутренним стандартом. Изначально Y в исследуемых пробах отсутствует, но его вводят в ходе пробоподготовки таким образом, чтобы концентрация Y во всех пробах была одной и той же (близкой к ожидаемой концентрации Х). Если в испаритель случайно

498

введут слишком малый (или слишком большой) объем какой-либо пробы, то это одинаково повлияет на площади пиков X и Y, но не отразится на относительной (нормированной) площади пика Х.

В одном из вариантов метода внутреннего стандарта используют набор образцов сравнения с разными концентрациями Х. Для каждого образца определяют нормированные сигналы Х, строят градуировочный график в координатах Sотн – Сх и пользуются им для последующего анализа проб неизвестного состава. В другом варианте по хроматограммам ряда образцов сравнения заранее рассчитывают коэффициент k в формуле (7.20) и затем используют его в серийных анализах проб неизвестного состава. Можно применять метод добавок и т. п. Разные варианты расчета Сх и соответствующие расчетные формулы приведены в современных практикумах по курсу аналитической химии, а также в специальной литературе. Метод внутреннего стандарта обычно дает более точные результаты, чем метод абсолютной калибровки.

Вхроматографии (в отличие от многих других аналитических методов) результат анализа можно получить даже в том случае, когда

враспоряжении аналитика нет вещества Х в чистом виде или образца сравнения с точно известной концентрацией Х. Тогда следует ис-

пользовать метод внутренней нормировки (метод нормализации).

Этот быстрый и простой метод применяют даже при наличии образцов сравнения, особенно если цель анализа – определение полного состава исследуемого объекта.

Вметоде внутренней нормировки расчеты ведут по формуле:

где Сi,% – массовая доля i-го компонента пробы; Si – площадь i-го пика на хроматограмме пробы; ki – коэффициент чувствительности используемого детектора к i-му компоненту пробы. Суммирование площадей ведут по всем пикам хроматограммы.

Метод внутренней нормировки применим далеко не всегда. Его нельзя применять, если:

проба не полностью испаряется при вводе в хроматограф;

499

при испарении или разделении каких-либо компонентов пробы идут химические реакции;

некоторые компоненты пробы остаются в колонке или после выхода из нее не регистрируются детектором (в обоих случаях число пиков меньше числа компонентов пробы);

нет полного разделения пиков на хроматограмме;

детектор дает нелинейный отклик на концентрацию какоголибо компонента пробы.

Если детектор имеет практически одинаковые коэффициенты чувствительности ко всем предполагаемым компонентам пробы (например, ДИП), то предварительный полный качественный анализ пробы не требуется. Формула (7.21) существенно упрощается, массовая доля любого компонента рассчитывается просто как отношение площади его пика к сумме площадей всех пиков на хроматограмме.

При использовании детекторов с неодинаковой чувствительностью к разным компонентам пробы (например, катарометра) проявляется серьезный недостаток метода внутренней нормировки. А именно: становится необходимым предварительный качественный анализ пробы. Без этого не удастся найти в литературе или определить опытным путем коэффициенты чувствительности детектора для каждого из пиков хроматограммы. Естественно, надежное опознание всех компонентов сложной смеси требует больших затрат труда и времени, а иногда часть пиков на хроматограмме смеси так и не удается опознать. Тогда для количественного анализа лучше использовать метод внутреннего стандарта, особенно если целью анализа является определение лишь одного из компонентов пробы.

Относительная погрешность количественного хроматографического анализа невелика (1 % и менее), особенно при использовании современных хроматографов с автоматизированным вводом пробы и компьютерной обработкой данных. Возможность грубых ошибок при проведении хроматографического анализа обычно связана с неверным отнесением пиков.

7.9.Селективность и эффективность разделения*

При теоретическом рассмотрении хроматографического процесса можно делать различные упрощения. Например, первые исследователи исходили из самой простой модели процесса, так называемой модели линейной равновесной хроматографии. Это означает, что при рассмотрении процессов, идущих в хроматографической колонке, изотерму сорбции считали ли-

500