1 курс / Химия / Uchebnik_Osnovy_analiticheskoy_khimii

кислых средах, предотвращает растворение металла в кислоте. Через редуктор пропускают анализируемый раствор. Происходит реакция: 2 Fe3+ + Zn = 2 Fe2+ + Zn2+ . Вытекающий из редуктора раствор собирают и оттитровывают. Важно, что избыток твердого восстановителя Zn(Hg) в анализируемый раствор не попадает, а ионы Zn2+ не мешают перманганатометрическому (дихроматометрическому) титрованию ионов Fe2+.

4.8. Кинетические и биохимические методы анализа*

4.8.1. Кинетические методы

Первые работы, в которых содержание какого-либо вещества в растворе находили по скорости реакции, протекающей с участием этого вещества, появились в 30-х гг. XX века. В 50–60-х гг. была развита теория нового метода, разработаны и опубликованы сотни методик. Решающую роль в создании кинетических методов анализа сыграл советский ученый К.Б. Яцимирский. В настоящее время кинетические методы используются довольно часто, преимущественно при определении микрограммовых количеств тяжелых металлов и биологически активных органических веществ.

В отличие от классических методов химического анализа (гравиметрия, титриметрия и др.), в кинетических методах аналитический сигнал измеряют в динамических условиях, т. е. используют системы, движущиеся к равновесию. Кинетические методы основаны на зависимости скорости реакции mA + nB ↔ pC + qD, протекающей в растворе, от концентрации одного из реагентов. В случае, когда в реакции участвует катализатор, скорость реакции зависит и от концентрации катализатора:

где k – константа скорости реакции; СA, СB и Скат – текущие концентрации реагирующих веществ и катализатора соответственно; m и n – коэффициенты (в простейшем случае – стехиометрические коэффициенты m и n).

Реакцию, скорость которой зависит от концентрации определяемого вещества, называют индикаторной. Скорость этой реакции в кинетических методах является аналитическим сигналом.

Скорость индикаторной реакции (v) рассчитывают по изменению концентрации одного из реагентов в единицу времени. Обычно начальные концентрации всех реагентов известны, поэтому для нахождения скорости достаточно определять текущую (меняющуюся во времени) концентрацию

301

одного из них. Можно следить за уменьшением концентрации какого-либо из исходных веществ или за увеличением концентрации одного из продуктов реакции. Вещество, по изменению концентрации которого судят о скорости индикаторной реакции, называют индикаторным1. Для наблюдения за изменением концентрации индикаторного вещества во времени, как правило, используют инструментальные методы. А именно: реагирующие вещества смешивают в подходящем сосуде и затем непрерывно или в определенные моменты времени измеряют какое-либо физическое свойство раствора, функционально связанное с концентрацией индикаторного вещества.

Индикаторная реакция должна отвечать определенным требованиям:

а) концентрация определяемого компонента не должна существенно изменяться за время наблюдения. Для катализатора это условие выполняется всегда, так как он не расходуется в процессе реакции. Если же определяемым является одно из реагирующих веществ, то с достаточной точностью его концентрацию можно определять в тот начальный период реакции, в течение которого его концентрация изменяется не более чем на 5 %;

б) необходимо наличие быстрого, простого и доступного метода наблюдения за скоростью индикаторного процесса, т. е. за изменением концентрации индикаторного вещества во времени;

в) скорость индикаторной реакции должна находиться в определенных пределах. Обычно время наблюдения за скоростью индикаторного процесса составляет 5–15 мин. Очень медленные реакции использовать нецелесообразно, так как удлиняется время анализа; а для измерения скорости очень быстрых реакций требуются сложные и не очень точные методы. Следует, однако, отметить, что с развитием методов изучения быстрых процессов в качестве индикаторных стали использовать и реакции, протекающие в течение нескольких секунд.

Способы определения концентрации по кинетическим данным.

Если текущую концентрацию индикаторного вещества – продукта реакции – обозначить через х, то скорость реакции можно выразить как

Если концентрация хотя бы одного из реагирующих веществ за время наблюдения за скоростью реакции заметно (более чем на 10 %) изменяется, то между концентрацией индикаторного вещества и временем реакции существует довольно сложная (например, логарифмическая) зависимость. Ее можно использовать для расчета скорости реакции. Соответствующие варианты кинетических методов называют интегральными.

1 Не следует смешивать такие вещества с индикаторами, используемыми в титриметрическом анализе!

302

Если же за время наблюдения концентрации исходных реагентов А и В не успевают заметно измениться, их можно считать постоянными величинами. Тогда, проинтегрировав уравнение (4.53), получим

Формула (4.54) показывает, что в начальный момент реакции концентрация индикаторного вещества (продукта реакции) возрастает во времени линейно. Тангенс угла наклона прямой в координатах x – t (tg ) прямо пропорционален скорости реакции. Кинетические методы, основанные на использовании уравнения (4.54), называют дифференциальными.

Существуют три основных способа определения неизвестной концентрации одного из реагентов (например, вещества А) по данным кинетических измерений: способ тангенсов, способ фиксированного времени и способ фиксированной концентрации.

Способ тангенсов предусматривает построение серии кинетических кривых в координатах x – t. Каждая кривая отвечает некоторой концентрации аналита (рис. 4.16а). Прочие условия измерений одинаковы. Затем строят графическую зависимость величины tgα от концентрации определяемого вещества (градуировочный график). Определяют tgα для раствора пробы и находят концентрацию аналита по градуировочному графику.

Способ фиксированного времени заключается в том, что при строго фиксированном времени протекания реакции определяют концентрацию образовавшегося за это время индикаторного вещества. Это делают несколько раз в присутствии проб, содержащих разные известные концентрации определяемого соединения. Градуировочный график строят в координатах:

концентрация индикаторного вещества при фиксированном времени реак-

ции – концентрация аналита (рис. 4.16б). Часто при работе способом фиксированного времени индикаторную реакцию останавливают через определенный промежуток времени резким изменением кислотности раствора, охлаждением, добавлением вещества-ингибитора или другим способом.

В способе фиксированной концентрации в присутствии различных проб, содержащих известные концентрации определяемого соединения, проводят индикаторную реакцию до строго фиксированной концентрации индикаторного вещества, например, до полного обесцвечивания раствора. Градуировочный график строят в координатах величина, обратная времени достижения фиксированной концентрации, – концентрация определяемого соединения (рис. 4.16в). Все три описанных способа применимы для дифференциального варианта кинетических методов. В интегральном варианте способы определения неизвестной концентрации вещества аналогичны, но более сложны. Наиболее часто в кинетических методах применяют способ тангенсов как наиболее точный и универсальный. Реже применяют способы фиксированного времени и фиксированной концентрации, хотя они более просты и менее трудоемки. При проведении серийных анализов все три способа могут быть использованы в автоматизированных вариантах.

303

ант. Вещества, повышающие каталитическую активность катализатора, называются активаторами, а понижающие ее – ингибиторами. Следует отметить, что катализаторами химических процессов могут быть как неорганические (ионы металлов, анионы), так и органические (азот-, серо-, фосфорсодержащие) соединения. Аналитические возможности некаталитических и каталитических кинетических методов различны .

Некаталитические методы не отличаются высокой чувствительностью, но они селективны, позволяют определять в смеси близкие по свойствам вещества без их предварительного разделения. Например, два сходных по химическим свойствам соединения А и В реагируют с одним и тем же реагентом R, образуя продукты P1 и Р2 , но реакция с участием вещества А идет гораздо быстрее, имеет гораздо большую константу скорости (k1 > k2). Для того чтобы определить один из компонентов в смеси с достаточной точностью, необходимо относительно большое различие в константах скорости реакций этих компонентов с одним и тем же реагентом. Добиться этого можно, изменяя рН или температуру системы, подбирая соответствующие растворители и т. д. Если k1/k2 > 500, то в начальный период реакции возможно определять вещество А на фоне вещества В с погрешностью < 1 %. Если же константы скорости реакций взаимодействия с реагентом близких по свойствам компонентов смеси мало отличаются друг от друга, а увеличить различие до предела, позволяющего пренебречь одной из реакций, не удается, используют специальные расчетные методы. Так, еще в 1930 г. в США был предложен остроумный и достаточно точный способ раздельного определения изомеров бутена, основанный на различной скорости взаимодействия продуктов их бромирования с KI. Некаталитические кинетические методы применяют для анализа смесей органических соединений (спиртов, сахаров, аминов), а также для анализа смесей близких по свойствам ионов металлов (щелочноземельные или редкоземельные элементы).

Каталитические методы анализа (в отличие от некаталитических)

характеризуются высокой чувствительностью. Представим кинетическое уравнение каталитической реакции в следующем виде:

x

и преобразуем его в выражение Скат = . (4.59)

t k C Am CBn

Из уравнения (4.59) видно, что снизить Скат можно следующими способами:

снижать ∆x. Чтобы регистрировать очень малые изменения концентрации индикаторного вещества, надо использовать наиболее чувствительные способы измерения его концентрации;

305

повышать ∆t, т. е. увеличить время наблюдения за протеканием индикаторной реакции;

использовать оптимальные (как правило, высокие) концентрации реагентов А и В.

Наиболее эффективным приемом повышения чувствительности каталитических методов является увеличение константы скорости каталитической реакции (k) за счет введения активаторов, оптимизации рН раствора, повышения температуры, проведения процесса в водно-органических средах.

Если в настоящее время в аналитических лабораториях используются методики, в которых определяют вещества-катализаторы на уровне 10–12 –10–10 М, то за счет перечисленных выше приемов можно определять еще меньшие концентрации. Главным преимуществом каталитических методов является сочетание уникальной чувствительности с простотой и дешевизной оборудования, необходимого для проведения анализа.

Реальную чувствительность каталитических методов ограничивает протекание (наряду с каталитической) некаталитической реакции, обусловленной наличием различных примесей в реактивах и воде или другом растворителе. Все это создает «фон», колебания которого ограничивают предел обнаружения катализатора. Уменьшить влияние фона возможно, используя реактивы и растворители высокой степени чистоты.

Варьируя условия проведения реакции (концентрации реагентов, рН, природу растворителя), используя активаторы и маскирующие вещества, можно добиться того, что катализатором в индикаторной реакции будет только одно соединение – определяемый компонент. Однако добиться этого удается не всегда. Каталитические методы используют для определения

микроколичеств металлов, прежде всего первого переходного ряда и группы платиновых металлов, а также для определения некоторых анионов (I–, Сl–, Вr–, S2–). Органические вещества, особенно токсичные и лекарственные препараты, определяют как по их собственному каталитическому действию в индикаторных реакциях, так и по их ингибирующему или активирующему действию на ион металла-катализатора. Кинетические методы используют в анализе биологических объектов и объектов окружающей среды, в клиническом анализе, а в некоторых случаях – и в заводских лабораториях. При условии строгого соблюдения условий проведения анализа кинетические методы не уступают другим методам по точности, достаточно экспрессны, легко поддаются автоматизации. Реальная чувствительность определения многих веществ каталитическими методами сопоставима с чувствительностью масс-спектральных, активационных и хроматографических методов анализа. Но каталитические методы имеют важное преимущество: для них не требуется сложное и дорогое оборудование.

306

4.8.2. Ферментативные и иммунохимические методы

Среди каталитических методов наиболее высокой чувствительностью и селективностью обладают ферментативные методы, основанные на использовании реакций, катализируемых ферментами – биологическими катализаторами, ускоряющими химические процессы в живых организмах и вне их. Эти методы стали применяться в аналитических лабораториях в 70-е гг. XX века. С их помощью можно определять сами ферменты, их субстраты (т. е. соединения, превращения которых катализируют ферменты), а также соединения, воздействующие на каталитическую активность ферментов, –

их эффекторы (активаторы или ингибиторы).

Ферменты обладают уникальными свойствами, которые отличают их от других катализаторов. Прежде всего, это необычайно высокая каталитическая активность. Добавка очень незначительного количества фермента (10–9–10–7 М) иногда ускоряет превращение субстрата в 108–1012 раз. Другое важное свойство – специфичность действия ферментов в отношении структуры субстрата, типа индикаторной реакции и условий ее проведения. Специфичность фермента – это прежде всего его способность ускорять превращение только одного типа субстратов (например, одноатомных спиртов), а иногда – только какого-либо одного субстрата. Так, фермент уреаза катализирует только гидролиз мочевины. Вместе с тем эффективно влияет на скорость этой индикаторной реакции только уреаза. Специфичность взаимодействия в паре фермент-субстрат, неоднократно сопоставлявшаяся со специфичностью пары «ключ–замок», обусловлена сложной структурой и весьма сложным механизмом действия фермента.

Ферменты – сложные белковые молекулы, представляющие собой высокомолекулярные соединения, состоящие из -L-аминокислот, связанных друг с другом пептидными (амидными) связями. Белковая часть фермента (апофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (кофакторами); такой комплекс называется холоферментом. Основной частью фермента, определяющей его каталитические свойства, является активный центр – участок белковой молекулы, на котором происходит превращение субстрата (рис. 4.17). Иногда в активном центре фермента выделяют участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, содержащий каталитически активные группы белка (кофакторы). Часто эти участки совпадают. Как правило, активный центр находится в углублении («кармане») белковой глобулы, размерам и форме которого должна соответствовать молекула субстрата. Для многих ферментов характерно наличие регуляторных участков, которые взаимодействуют с веществами, влияющими на активность фермента, т. е. активаторами или ингибиторами.

Механизм действия ферментов включает сорбцию субстрата на активном центре фермента и образовании активного комплекса (фермент-

307

субстрат) в результате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий. В этом комплексе происходит сближение и ориентация реагирующих групп фермента и субстрата. Взаимодействие между ферментом и сорбированным субстратом носит полифункциональный характер, при котором молекула субстрата подвергается атаке сразу нескольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловливает его высокую каталитическую активность.

Рис. 4.17. Процессы в активном центре фермента (превращение субстрата S в продукты РР) и его регуляторных участках (взаимодействие с ингибитором и активатором)

Скорость реакций с участием ферментов можно измерять разными способами. Чаще всего применяют фотометрические методы. При этом в качестве индикаторных используют катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстанови- тельные реакции), а также гидролизами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы контроля ферментативных реакций. Контролировать скорость биохимических реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окис- лительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода или образованием Н2О2, удобно электрохимическими методами (потенциометрия, амперометрия и т. д.).

Скорость ферментативных процессов зависит от концентрации целого ряда веществ (фермента, субстрата, эффекторов), а также от величины рН и температуры. Градуировочным графиком будет зависимость скорости реакции от концентрации одного из участников (фермента, или субстрата, или эффектора). Остальные факторы должны быть строго постоянны. Но в ферментативном анализе градуировочные графики строят редко, чаще применяют способ фиксированного времени. Для определения субстратов или эффекторов знать точную концентрацию соответствующих ферментов не обязательно, достаточно во все пробы (и эталоны) вводить одно и то же ко-

308

личество ферментсодержащего раствора. Поэтому в ферментативном анализе вначале основное внимание уделялось количественному определению субстратов. Примеры – определение глюкозы или холестерина в крови. Эти показатели важны для диагностики и для контроля лечения ряда заболеваний, например диабета или атеросклероза. Еще больше работ посвящено методам определения эффекторов – как неорганических (ионы тяжелых металлов, прежде всего ионы ртути; разные анионы, например фториды), так и органических. Например, фосфорсодержащие пестициды определяют по ингибированию ими фермента холинэстеразы; различные фенолы определяют с помощью пероксидазы. Методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, но более чувствительны, чем методы определения суб-

стратов. Так, пределы обнаружения многих субстратов находятся в диапазоне 10–6–10–4 М, а органических эффекторов – 10–11–10–8 М, причем число эф-

фекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов.

При практическом использовании ферментов важно учитывать их стабильность, т. е. способность сохранять активность в течение длительного времени. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация, т. е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование растворимыми в воде полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитической активности. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно снижают стоимость ферментативных методов анализа.

Ферментативные методы находят широкое применение в анализе самых разнообразных объектов – медицинских (биологических жидкостей, тканей живых организмов), пищевых продуктов, фармацевтических препаратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве. Методы используют для определения токсичных органических и неорганических соединений в объектах окружающей среды

– сточных, природных водах (речных, морских, подземных), почвах, воздухе, листьях растений.

Иммунохимические методы. К биохимическим методам, кроме ферментативных, относят и иммунохимические методы. Напомним, что генетически чужеродные вещества, попадая в организмы высших животных и человека, способны вызывать в них ряд специфических процессов, направленных на удаление этих веществ из организма. Система, регулирующая эти специфические процессы, называется иммунной, а сами процессы – иммунологическими. Вещества, способные вызывать специфические иммунологические реакции в организме, в том числе биосинтез специфических антител, называют антигенами. К антигенам относятся, в частности, белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты. Важнейший иммунологический процесс – образование специфиче-

309

ских белков крови – антител (иммуноглобулинов). Биологическая функция антител состоит в защите организма от чужеродных веществ (антигенов) путем их распознавания, специфического связывания в прочные иммунные комплексы и удаления их из организма. Таким образом, иммунохимические мето-

ды анализа основаны на специфическом связывании определяемого соединения

– антигена – соответствующими антителами. Иммунохимическая реакция представляет собой сложный процесс, протекающий в несколько стадий. В иммунохимическом анализе принципиально возможно использование только первой стадии – обратимого образования комплекса (антиген-антитело) состава 1:1. Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании осадка при взаимодействии антител с антигенами. За протеканием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие концентрации компонентов. Эти методы длительны и трудоемки.

В самом конце XX века возник другой вариант иммунохимического анализа – иммуноферментный метод (к числу кинетических методов его не относят). Высокая чувствительность кинетического определения ферментов удачно сочетается в этом случае с уникальной специфичностью иммунохимического взаимодействия определяемых веществ (антигенов) с вырабатываемыми организмом антителами. Создание экспрессных и высокочувствительных иммуноферментных методов определения белков, гормонов, стероидов, наркотических и лекарственных веществ, вирусов и отдельных клеток было очень важно для клинического (биохимического) анализа. Оно также позволило к началу XXI века разработать иммуноферментные тестсистемы для микробиологической, фармакологической и пищевой промышленности, для ветеринарии и сельского хозяйства, а также для контроля загрязнения окружающей среды.

Контрольные вопросы

1.Какие задачи могут быть поставлены перед аналитиком при проведении качественного анализа?

2.Какими внешними эффектами сопровождаются качественные реакции? Приведите примеры.

3.Какие величины характеризуют чувствительность качественной реакции? Как можно повысить чувствительность? Какие приемы позволяют улучшить селективность качественной реакции?

4.В чем состоит дробный и систематический ход качественного анализа смесей? В каких случаях предпочтительнее каждый из них?

5.Какими свойствами должны обладать групповые реагенты для систематического качественного анализа? Приведите примеры реагентов

310