книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

V. Структура митотических хромосом и з

хромосомы на ультратонких срезах образуют структуры такого же порядка, как в интерфазных ядрах,— из тесно располагающихся нитчатых элементов толщиной 0,2—0,3 мк. Тем самым в теле профазных хромосом определяется подразделение их на структуры промежуточного характера, на субхроматиды, имеющие нитчатую организацию. Для обозначения таких нитчатых хроматпновых структур, имеющих размер значительно больший, чем фибрилла ДНП, и значительно меньший, чем поперечник хромосомы, мы ис­ пользуем дермин старых авторов — хромонема.

По мере продвижения профазы отдельные отрезки хромонем располагаются все теснее, в результате чего резче проступают кон­ туры хромосом. В поздней профазе расположение хромонем стано­

Размер и плотность отдельных хромонем в процессе прохожде­ ния профазы несколько меняются. Повышается электронно-оптиче­ ская плотность этих нитчатых образований, повышается степень их окрашивания, уменьшаются их поперечные размеры. Так,

у Crepis capillaris их диаметр уменьшается с 0,35 до 0,2—0,15 мк.

Усмотреть порядок в расположении этих нитчатых структур на ультратонких срезах довольно трудно. Часто сечения отдельных хромонем имеют вид незамкнутых колец или петель, близко распо­ ложенных одна к другой, что может указывать на сворачивание их или спирализацию (см. табл. 22, 23).

Не менее четко хромонемные элементы выявляются в составе профазных хромосом животных (табл. 24). Так же как в хромосо­ мах растений, характерное петлеобразное расположение хромонем указывает на их возможную спиральную укладку в теле профазной хромосомы.

Таким образом, изучение профазных хромосом как животных, так и растительных объектов показывает, что процесс конденсации хромосом происходит не за счет постепенного уплотнения отдель­ ных элементарных хромосомных фибрилл ДНП, а включает в себя промежуточный этап — образование нитчатых хромопемных струк­ тур, являющихся единицей последующей хромосомной структури­ зации.

В связи с этими наблюдениями чрезвычайно важным представ­ ляется изучение тонкой организации хромонемных элементов. Наиболее подходящим объектом для этой цели служат интерфаз­ ные ядра высших растений, в которых хромонемные структуры выражены особенно отчетливо (см. табл 10, 12, 21). Однако попыт­ ки разобраться в том, каков характер упаковки фибрилл ДНП в со­ ставе хромонемы, наталкиваются на методические трудности. Мето­

дика ультратонких срезов дает мало полезной информации о струк­ туре хромонемы, так как по отдельным произвольным сечениям не­ возможно судить об общей организации этой структуры. Если же прибегнуть к известным методам выделения хроматина, то возни­ кает серьезная опасность артефактных изменений, которые могут привести к слипанию отдельных хромонем или к их разрывам. Час­ тично выход из положения дает метод, позволяющий исследовать хромонемные элементы как бы на «тотальных» препаратах, без предварительного разрушения ядер (Ченцов и др., 1973). Суть ме­ тода состоит в следующем: ядра, выделенные из зоны меристемы корешков Allium сера в растворе Хенкса фиксировали глютатовым алвдегидом и затем заключали в водорастворимую среду, представляющую собой смесь поливинилпирролидона с сахарозой. Через некоторое время заливочная среда вместе с ядрами загусте­ вала, после чего производили резку блока па толстые (1—5 мк) срезы. Полученные срезы, помещенные на поверхность капли воды, теряют заливочную среду за счет ее растворения в воде, в резуль­ тате чего на поверхности водного мениска располагаются фрагмен­ ты ядер, которые можно перенести на сетку с пленкой-подложкой для электронномикроскопического изучения.

На табл. 6, 10, 12 представлены микрофотографии ультратон­ ких срезов ядер различных растений. Из-за того что толщина ультратонкого среза меньше, чем диаметр хромонемы, разобрать­ ся в организации хромонемных элементов на таких препаратах не представляется возможным. На табл. 25 помещена микрофотогра­ фия толстых срезов ядер меристемных клеток А. сера, получен­ ных с помощью описанного выше метода заливки в водораствори­ мую среду. Этот способ обработки ядер полностью сохраняет об­ щую композицию внутри ядра. При больших увеличениях удается подробнее разобраться в принципе организации хромонемных структур. Как видно, хромонема представляет собой плотный тяж, составленный из отдельных фибрилл ДНП. Взаимное расположе­ ние этих фибрилл лишено какой-бы то ни было упорядоченности, из чего можно заключить, что в составе хромонемы отсутствуют элементы спиральной организации. По длине структура хромонема выглядит неоднородной — зоны плотного расположения фибрилл ДНП сменяются участками их более рыхлой упаковки (см. табл. 25). В этих разрыхленных зонах хромонем видно, как на большом протяжении отдельные фибриллы ДНП располагаются параллельно длинной оси хромонемы. Именно наблюдение за такими участками приводит к мысли о том, что хромонема состоит из многих продоль­ но уложенных молекул ДНП. Обрабатывая ядра перед их фикса­ цией растворами с различной ионной силой — как низкой (0,07 М NaCl), так и высокой (0,35 М NaCl),— удается слегка разрыхлить хромонемные элементы. В этих случаях еще наглядней выступает продольное расположение многочисленных фибрилл ДНП в составе

этой структуры. Таким образом, можно прийти к выводу, что хро­ монема представляет собой пучок плотно уложенных фибрилл ДНП. Отсутствие элементов спиральной организации позволяет го­ ворить о том, что общий спиральный принцип организации хро­ мосомы неприменим к хромонемпым элементам интерфазных ядер. По-видимому, на этом уровне мы имеем дело с более упрощенной формой организации хроматина, заключающейся в продольном расположении многих молекул нуклеогистона.

Хромосомы растений на стадии метафазы имеют вид плотных тел, лишенных субструктуризации. Контур их резко выражен, име­ ет неровный характер. Иногда на поверхности хромосом видны не­ большие выросты, что создает впечатление спиральности всей ее структуры (см. табл. 26). Тело хромосом в метафазе состоит из множества плотно упакованных фибрилл толщиной около 200 А, проследить за порядком их упаковки на ультратонких срезах не­ возможно. Никаких признаков хромонем или иных нитчатых об­ разований, кроме фибрилл толщиной 200 А, не выявляется.

В зонах хромосомных перетяжек фибриллы располагаются более рыхло, иногда в виде нескольких пучков.

Это описание структуры метафазных хромосом растений мож­ но полностью повторить для хромосом животных — на ультратон­ ких срезах метафазные хромосомы клеток культуры ткани СПЭВ, асцитной карциномы Эрлиха (см. табл. 27) и других объектов выг­ лядят плотными, компактными телами, лишенными подразделения на субхроматиды.

Если ограничиться изучением структуры хромосомы на стадии метафазы, может создаться впечатление, что хромосомы не имеют субструктуризации на субхроматидные элементы. Именно к таким выводам приходят некоторые из авторов, имевших дело с выделен­ ными метафазными хромосомами (Du Praw, 1965, 1966, 1968; Co­ mings, Ocada, 1969). Согласно другой точке зрения, субхроматиды сохраняются и в метафазе, а то, что их не удается обнаружить в составе метафазных хромосом, объясняется плотной, компактной упаковкой хромонемных элементов и присутствием экстрахромосомного материала, маскирующего истинную структуру хромосом (Sparvoli et al., 1965). Если это предположение верно, то воздей­ ствия, приводящие к разрыхлению хромосом, должны выявить хромонемные элементы и в метафазе.

Из различных факторов, вызывающих разрыхление хромосом, наиболее часто используются такие, как ЭДТА (Kaufmann, McDo­ nald, 1956), KCN (Ris, 1957), фенэтиловый спирт (Bami, Jura, 1966) и соли кобальта (Herich, 1965).

При электронномикроскопических наблюдениях в клетках корневой меристемы Crepis capillaris после воздействия ЭДТА, KCN и фенэтиловым спиртом наблюдались значительные измене­ ния: набухание митохондрий, изменение мембранных структур

116 Судьба компонентов ядра в митозе

цитоплазмы, набухание и увеличение размера ядрышка. В ядрах уменьшалась толщина хроматиновых фибрилл до 100—150 А. На­ рушалась и вторичная структуризация хроматина: в интерфазных ядрах появлялись неправильной формы скопления хроматина. В профазных и телофазных хромосомах хромонемные нити не вы­ являлись.

В этих случаях также происходит общее набухание митотиче­ ских хромосом за счет утоиынения элементарных фибрилл и пол­ ного исчезновения вторичной организации хромосомы. Именно поэтому данный тип воздействий был нами отвергнут.

Электронномикроскопическое исследование корешков Crepis capillaris, обработанных растворами солей кобальта, привело к со­ вершенно иным результатам (Поляков, Ченцов, 1968).

Воздействие 2%-ным водным раствором СоС12 не вызывает за­ метных нарушений в морфологии митохондрий, ядрышка, рибосом и мембранных элементов клетки. В интерфазных ядрах наруше­ ний в структуре не наблюдается: ядра имеют глыбчатый вид, раз­ мер глыбок такой же, как в контроле. Структура клеток в профазе н телофазе также не менялась. Профазные и телофазные хромосо­ мы имеют такое же строение, как и в норме, в них отчетливо вы­ являются хромонемные структуры.

При электронпомикроскопическом изучении «разрыхленных» под действием Со (N03)2 или СоС12 метафазных хромосом в их составе выявляются плотные нитчатые образования толщи­ ной 0,2—0,3 мк, располагающиеся на некотором расстоянии друг от друга. Морфологически эти нити сходны с описанными выше хромонемами профазных и телофазных хромосом. Таким образом, соли кобальта вызывают разрыхление, деконденсацию хромосом в метафазе, связанную с расхождением хромонемных структур. Другими словами, происходит истинное разрыхление хромосомы без изменения ее составляющих элементов. Анафазные хромосомы в этом случае также несколько больше разрыхлены, чем в норме

(см. табл. 28).

Разрыхление метафазных хромосом под действием солей ко­ бальта сопровождается еще одним интересным явлением: вокруг разрыхленных хромосом появляется компонент, отличающийся по плотности и структуре от хроматина и окружающей цитоплазмы. Мы называем этот компонент хромосомным матриксом (стр. 131). Появление хромонемных структур удалось вызвать также в мета­ фазных хромосомах животных после инкубации клеток культуры ткани СПЭВ в гипотонической среде — растворе Хенкса, разбав­

в первый момент после помещения клеток в гипотоническую среду сильно набухают ядра и митотические хромосомы. Затем, через 5—10 мин., структура ядер возвращается к норме, в делящихся

клетках вновь четко выявляются хромосомы. Электронномикроско­ пическое исследование таких «адаптировавшихся» к гипотониче­ ским условиям клеток показало, что в хромосомах выявляются нитчатые структуры, по своему диаметру сходные с хромонемными элементами профазных хромосом (см. табл. 29).

Таким образом, в хромосомах как растений, так и животных нооле некоторых воздействий, приводящих к разрыхлению хромо­ сом, удается наблюдать хромонемные элементы.

В ранней анафазе структура хромосом практически не изменя­ ется. Так же как на стадии метафазы, анафазные хромосомы пред­ ставляют собой плотные образования, состоящие из тесно уложен­ ных элементарных фибрилл. В поздней анафазе, когда хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре выяв­ ляются хромонемы — нитчатые образования толщиной около 0,2 мк. При этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает на­ чало деконденсации митотических хромосом. Эта деконденсация связана не с разрыхлением фибрилл внутри хромонем, а с расхож­ дением хромосом. Особенно заметным и выраженным этот про­ цесс становится в телофазе. В тех случаях, когда на препаратах попадались поперечные сечения анафазных хромосом, они выгля­ дели как кольцевые структуры (см. табл. 30).

Для ранней телофазы, когда вокруг хромосом начинают пояь ляться первые элементы ядерной оболочки, характерна дальнейшая деконденсация хромонем, которая на этой стадии выявляется очень отчетливо. Сами телофазные хромосомы-хроматиды увеличиваются в объеме. Расстояние между отдельными участками хромонемы также увеличивается. В расположении отдельных нитей хромонемы, так же как в профазных хромосомах, улавливаются признаки спиральности в укладке: часто видны кольчатые или петлистые не­ замкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно друг ДРУгу (см. табл. 31). Элементы хромонемы сохраняют свои раз­ меры (толщина около 0,2—0,3 мк). Кроме хромонем, уже в ранней телофазе видно обособление вокруг хромосом компонентов мат­ рикса.

В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядер­ ной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся друг от друга на значительные расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются (см. табл. 31). В это время некоторые участки хро­ монем начинают разрыхляться, их толщина увеличивается До U,2—0,4 мк.

Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и располо­ жением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть картину, обратную той, которая наблюдалась в про­ фазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения хромонемных участков и последующего разрыхления самих хро­ монем.

118 Судьба компонентов ядра в митозе

Мы видели, что в электронном микроскопе нитчатые, хромонемные структуры выявляются на всех стадиях митоза, за исключени­ ем поздней профазы, метафазы и ранней анафазы. Возможное объ­ яснение этих исключений, вероятно состоит в том, что на указан­ ных стадиях из-за максимальной конденсации хроматинового мате­ риала, из-за плотности в укладке происходит маскирование хромо­ немы. Это предположение было экспериментально проверено; вы­ звав искусственную деконденсацию метафазных хромосом солями кобальта, удалось убедиться в том, что и на этой стадии митоза в состав хромосом входят хромонемные элементы. Другой важный вопрос, оставшийся не до конца ясным после изучения ультратонких срезов, это способ упаковки хромонем в составе митотической хромосомы.

Как уже отмечалось, на сечениях хромосом отдельные хромо­ немные элементы располагаются в виде петель или кольцевых структур, что служит доводом в пользу их спиральной упаковки. Эти данные находятся в резком несоответствии с наблюдениями за ультраструктурой выделенных хромосом. Так, по утверждению не­ которых авторов, в составе митотической хромосомы, кроме эле­ ментарных фибрилл, не встречаются структуры более высокого по­ рядка организации — такие, как субхроматиды, и не наблюдается признаков спиральной упаковки хромосом (Du Praw, 1965; Co­ mings, Okada, 1969). На наш взгляд, это может объясняться тем, что выделение митотических хромосом в гипотонических условиях, без стабилизации их структуры, обязательно должно приводить к набуханию хромосом и потере их структуризации. Чтобы избежать этого, был использован тот же метод заключения фиксированного материала в водорастворимую среду, который применялся для изу­ чения структуры хромонем. В данном случае в смесь поливинилпирролидона с сахарозой заключался эндосперм тюльпана Tulipa turkestanica Rgl., предварительно фиксированный смесью 2%-ного глютатового альдегида и 2%-ного формалина и выделенный из се­ мяпочки. Так как эндосперм Tulipa характеризуется зональным распределением митозов, можно получить срезы со всеми стадия­ ми митозов, от профазы до телофазы. Срезы можно приготовить та­ кой толщины, чтобы они превышали диаметр хромосом, в результа­ те чего в плоскость среза будут попадать целые хромосомы. Таким образом, предоставляется возможность изучать общую структурную организацию хромосом подобно тому, как это делается с выделенными хромосомами.

Исследование таких, можно сказать, «тотальных» препаратов хромосом в делящихся клетках позволило подтвердить наблюдения о структуре хромосом, проведенные с использованием ультратонких срезов. На всех фазах митоза, включая метафазу, в составе хроматид выявляются структуры более низкого порядка, соответству­ ющие субхроматидам или хромонемам (см. табл. 32). На некоторых

препаратах отчетливо выявляется периодичность в расположении хромонем в составе хромосом, характерная для спиральной уклад­ ки субхроматид. В отдельных случаях, вероятно, когда просматри­ вается вся толщина хромосомы, видны более сложные картины, соответствующие проекции параллельно спирализованных субхро­ матид. Таким образом, в составе митотических хромосом на всех стадиях митоза выявляются субъединицы меньшей толщины, чем сама хроматида, и большей, чем ее элементарные хроматхшовые фибриллы. Эти единицы — хромонемы — обладают переменной ве­ личиной в зависимости от цикла конденсации хромосомы, но со­ ставляют в среднем около одной трети ее толщины (см. таблицу,

стр. 1112).

Хромонемное строение хроматид наблюдалось у всех изученных видов без исключения. Несколько хуже субхроматидная организа­ ция хромосом выявляется на клетках культуры ткани животных, возможно, в связи с малыми размерами хромосом в этих объектах, хотя и здесь на стадии профазы и телофазы субхроматидные эле­ менты выявляются достаточно четко.

Результаты наших наблюдений о хромонемном, или субхроматидном строении хромосомы согласуются с данными одних авторов, но в то же время содержат много сведений, не укладывающихся в представления целого ряда других авторов.

Так, как нам кажется, наши выводы о субхроматидном, хромо­ немном строении хромосом подтверждают данные Спарволи и др. (Sparvoli et al., 1965), которые также видели хромонемы у Tradescantia на всех стадиях, за исключением метафазы. По мнению этих авторов, отсутствие хромонем в метафазе может объясняться мас­ кированием этих структур «экстрахромосомным материалом». По­ пыток обнаружить какие-либо структуры, соответствующие хромонемам в метафазных хромосомах, эти авторы не делали.

В нашем случае после обработки корешков Crepis capillaris со­ лями кобальта происходило разрыхление тела хромосомы за счет расхождения ее субъединиц. При этом действительно обособлялся «экстрахромосомный материал» матрикса, но главной причиной, приводившей к обнаружению хромонемы, на наш взгляд, было их отталкивание и обособление друг от друга. Хроматида как бы рас­ кручивается, увеличивая свой общий объем. Но такое раскручива­ ние не является равномерным набуханием хромосомы за счет на­ бухания, утолщения и разрыхления ее хромонемных структур. Пос­ ледний тип набухания хромосом мы наблюдали при действии хелат­ ных агентов и фенэтилового спирта. На наш взгляд, действие этих веществ не имеет ничего общего с физиологической деконденсаЦией хроматид во второй половине митоза. На самом деле хелаты вызывают, в первую очередь, изменения на уровне элементарных фибрилл: фибриллы утоньшаются и расходятся, что вызывает об­ щее набухание хромонем и хроматид в целом.

120 Судьба компонентов ядра в митозе

Таким образом, действие солей кобальта выражается в специ­ фической деконденсации (а не в набухании) хроматид, напомина­ ющей по ряду признаков (обособление матрикса, сохранение хро­ монем, их расхождение и др.) нормальный процесс деконденсации в телофазе. Кроме того, при таком воздействии практически не из­ меняется морфология основных клеточных компонентов, и это дает основание считать воздействие солей кобальта не гибельным для клетки. По данным Хериха (Herich, 1965), действие растворов со­ лей кобальта вызывает обратимые эффекты, которые снимаются при отмывании солей водой. Гипотонический шок, который приво­ дит к выявлению хромонем в метафазных хромосомах животных, также можно отнести к воздействиям физиологического характера. По данным Бринкли, после перенесения клеток из разбавленного раствора Хенкса в нормальную культуральную среду они продол­ жают делиться (Brinkley, 1967).

Нет смысла перечислять и сравнивать данные старых цитоло­ гов и результаты наших наблюдений за субхроматидами в свето­ вом микроскопе — они полностью совпадают (см. обзор литерату­ ры — Данжар, 1948) в утверждении о том, что в основе структуры хроматид лежат нитчатые единицы — хромонемы.

Наши наблюдения не согласуются с данными некоторых авто­ ров, также поддерживающих представления о субхромагидности хромосом по ряду деталей.

Так, например, Байер (Bajer, 1965) при витальном наблюдении за хромосомами клеток эндосперма Haemantlnis katharinae обратил внимание на полухроматидную организацию хромосом в анафазе и телофазе. Исследуя хромосомы этого же объекта на ультратонких срезах, мы не видели признаков существования двух субъединиц, располагающихся на некотором расстоянии друг от друга в виде рыхлой двойной спирали. У Н. katharinae, как и у других объектов, в хромосомах видны хромонемы, но данных, показывающих, что их две, мы не смогли получить. Более того, есть ряд наблюдений, по­ казывающих, что и у этого объекта способ укладки хромонем такой же, как у V. faba или других изученных растений (кольца на по­ перечном сечении).

Троско и Вольфф (Trosco, Wolff, 1965) при ферментативном переваривании выделенных фиксированных хромосом V. faba об­ наружили с помощью светового микроскопа в их структуре четыре субъединицы, или четвертьхроматиды. Повторное исследование этого же объекта с помощью электронного микроскопа (Wolfe, Martin, 1968) позволило обнаружить субхроматидную организацию в хромосомах V. faba, но у V. sativa субхроматидность не выявля­ ется. Однако, по нашим наблюдениям, субхроматидность у V. sa­ tiva выявляется отчетливо как при исследовании хромосом в све­ товом микроскопе после окраски ацетокармином, так и на ультра­ тонких срезах в электронном микроскопе (см. табл. 33).

рованных хромосом, по данным Троско и Вольффа (Trosco, Wolff, 1965), приводила к развертыванию хромосом с увеличением их длины. Вероятно, такая обработка может привести к искусствен­ ной потере структуры (Wolfe, Martin, 1968).

Еще большие изменения в структуре хромосом могут проис­ ходить при выделении их в гипотонических условиях. Характерно, что ни в одной из работ, где при помощи электронного микроскопа изучались хромосомы, полученные в гипотонических растворах, нет описания субхроматид. Подобные артефакты дают возмож­ ность для появления умозрительных заключений, которые можно найти в работах Дю Про (Du Praw, 1968). Наши данные резко не согласуются с представлениями этого автора и показывают в хроматидах как существование субхроматид, так и признаков их спирализации при укладке в теле хромосомы.

Изменения структуры ядра в митозе показывают, что в ранней профазе появлению четко выраженных хромосомных зон и сфор­ мированных хромосом предшествует появление хромонемных структур, более или менее равномерно заполняющих весь объем ядра. Таким образом, в ядре первоначально происходит обособле­ ние элементов хромосом в виде хромонемных нитей, а затем их собирание в хромосомы. В пользу этого представления говорят факты об изменениях в структуре ядер при действии на клетки ионов Mg или Са. Конденсация хроматина, вызываемая этими ионами в живых ядрах, приводит к образованию нитчатых струк­ тур, сходных по размерам и морфологии с субхроматидами в про­ фазе или телофазе. То, что искусственная конденсация хроматина в ядрах под воздействием Mg2+ или Са2+ приводит не к беспорядоч­ ной агрегации, а к закономерной структуре, может говорить о том, что ионы Mg2+ и Са2+ лишь провоцируют образование струк­ туры хроматина в виде хромонемных тяжей и что принципы такой организации заложены в самом интерфазном ядре. Об этом же го­ ворит тот факт, что в выделенных ядрах растений не происходит реконструкция хромонемных элементов после набухания ядер в растворах высокой (0,4 М NaCl) и низкой (0,035 М NaCl) ион­ ной силы (Васин и др., 1972),.

Если такие набухшие ядра вновь поместить в раствор, содер­ жащий 0,14 М NaCl, хроматин вновь структурируется, однако об­ разующиеся глыбки хроматина имеют неправильную форму и совершенно не похожи на нитчатые хромонемы исходных ядер. По-видимому, в интерфазных ядрах на любой стадии клеточного Цикла сохраняются конденсированные элементы хромонемных структур, а их деконденсированные районы пространственно разоб­ щены. Именно начиная с конденсированных участков хромонем продвигается постепенная конденсация этих структур.