книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

Сам же процесс образования митотической хромосомы можно представить себе в виде двух этапов. Первый — конденсация хроматиновых фибрилл, приводящая к структуре типа хромонемы; второй — взаимная конденсация и уплотнение отдельных хромо­ нем или участков хромонемы в виде конечной структуры — хроматиды.

Каковы закономерности прохождения этих порядков структу­ ры и каковы их пусковые механизмы, пока неизвестно.

Получены некоторые данные о тонкой структуре хромонемы. Как было видно, в ее основе лежат хроматиновые фибриллы ДНП, сечения которых хорошо просматриваются на ультратонких сре­ зах.

Оказалось, что порядок их укладки не имеет признаков спираль­ ной организации, т. е. хромонемные единицы образуются не за счет еще одной степени спирализации фибрилл, толщиной 200 А, как это считают, например, Амано и др. (Amano et al., 1956), а путем продольного складывания фибрилл ДНП. Такое расположе­ ние фибрилл может отображать складчатый характер укладки од­ ной молекулы нуклеогистона, предположенный Дю Про (Du Praw, 1965).

Однако эксперименты по разрыхлению хромонемы показывают большую вероятность того, что хромонема представляет собой многонитчатую структуру. Если это действительно так, то отме­ ченную корреляцию между толщиной хромонемы, диаметром метафазной хромосомы и содержанием ДНК у близких видов расте­ ний можно объяснить исходя из представлений о многонитчатости хромосом на уровне хромонемных элементов, а именно тем, что в более толстых хромонемах содержится большее количество про­ дольно уложенных фибрилл ДНП.

Общие принципы упаковки хромонемных элементов

всоставе митотических хромосом

Впредыдущем разделе показано, что основной структурной едини­ цей, встречающейся в процессе формирования хромосом в митозе, кроме элементарных хроматиновых фибрилл, является хромонема. Порядок ее укладки в структуре хромосомы недостаточно ясен.

Единственная работа, связанная с анализом этого вопроса (Sparvo- П et al., 1965), авторы которой использовали электронный микро­ скоп, не дает достаточного количества доказательств для того, чтобы принять полностью их представления о четырех субхроматидах, попарно спирализованных в виде диплоспирем. Существует много данных, не укладывающихся в эту гипотезу. Основные из них — это результаты наблюдений за спирально закрученны­ ми полухроматидами.

Как уже говорилось, в световом микроскопе хромосома пред­ ставляется сложноорганизованной структурой, состоящей из не­ скольких субхроматид (полуили четвертьхроматид). Субхроматиды в виде полухроматид особенно хорошо видны в хромосомах на стадии анафазы или ранней телофазы после окраски ацетокар­ мином (см. табл. 33, 34, 35). Однако полухроматиды удается наб­ людать в анафазных хромосомах и без каких бы то ни было воз­ действий на живом материале (Bajer, 1965).

Перечисленные факты могут говорить о том, что в состав хро­ мосом входят по крайней мере две продольные независимые струк­ турные единицы. Однако некоторые наблюдения вызывают сомне­ ния в правильности такой интерпретации цитологических данных. Дело в том, что на препаратах пыльников Paeonia arborea, окра­ шенных ацетокармином, наряду с отчетливо видимыми параллель­ но расположенными или переплетенными в пологую спираль полухроматидами при наблюдении хромосом «с торца» проявляет­ ся их цилиндрическая организация (Поляков и др., 1969).

Чтобы разобраться в этом вопросе, было проведено сравнитель­ ное электронно- и светомикроскопическое исследование структуры хромосом на одном и том же объекте с использованием одинаковых фиксаторов и заливочных сред. Только при соблюдении этих усло­ вий, сопоставляя фотографии хромосом, полученные в световом микроскопе, с поперечными сечениями тех же самых хромосом, можно узнать, насколько соответствует действительности та орга­ низация хромосом, которая наблюдается в световом микроскопе.

Если наблюдения о существовании полухроматид в составе хромосом с помощью светового микроскопа отражают реально су­ ществующие структуры, то исследование этих же самых хромосом на срезах в электронном микроскопе должно также дать картину полухроматид.

С этой целью под световым микроскопом на окрашенном ацето­ кармином и заключенном в метакрилат препарате была выбрана анафаза, и хромосомы сфотографированы. На фотографии хорошо видны две взаимно переплетенные субхроматиды, образующие пологую спираль. После резки на ультрамикротоме этот же препа­ рат исследовали в электронном микроскопе. Оказалось, что на по­ перечных сечениях хромосомы имеют форму кольца, на продоль­ ных — сильно вытянутого эллипса (см. табл. 34) с отношением толщины стенки этих структур к диаметру хромосомы, составля­ ющим примерно 1:3. Такие сечения могут получиться только в том случае, если резали структуру, напоминающую полый цилиндр или трубку. Продольно расположенных полухроматид, видимых в световом микроскопе, наблюдать в этом случае не удалось.

Сечения в виде кольца или вытянутого эллипса, отражающие цилиндрическую, трубчатую организацию хромосомы, появляются на ультратонких срезах независимо от того, располагались ли суб-

124 Судьба компонентов ядра в митозе

хроматиды в хромосомах при наблюдении в световом микроскопе параллельно или казались взаимно переплетенными в пологую спираль. Однако в тонкой структуре сечений хромосом, находя­ щихся на разных стадиях митоза, имеются некоторые различия. Хромосомы анафазы обычно сильно вытянуты, и их субхроматидная организация проявляется менее четко по сравнению с хромо­ сомами поздней анафазы или телофазы. Именно такие хромосомы ранней анафазы дают на поперечных сечениях структуру в виде кольца со сплошными стенками (см. табл. 34). На более поздних стадиях (поздняя анафаза, телофаза) при наблюдении в световом микроскопе в хромосомах более четко выявляются субхроматиды, и, соответственно, картина их поперечных и продольных сечений становится иной. Хотя общая организация хромосомы на попереч­ ных сечениях сохраняет вид кольца, материал, составляющий стенки кольца, подразделяется на субъединицы различной формы, образующие полукольца, незамкнутые кольца и т. д. Продольные сечения телофазных хромосом показывают, что стенка образующе­ го их полого цилиндра также не остается сплошной (см. табл. 35). При таких сечениях видно, что боковые стенки рассеченных хро­ мосом состоят из отдельных нитчатых субъединиц, порядок распо­ ложения которых отражает спиральный тип их укладки. Особенно это хорошо видно при частичной реконструкции хромосом на не­ скольких серийных срезах.

Необходимо отметить, что при исследовании в электронном микроскопе срезов хромосом клеток культуры ткани фибробластов мышей после их окраски ацетокармином и заливки в метакрилат также выявляются кольцевидные структуры.

Таким образом, сопоставление морфологии хромосом, окра­ шенных ацетокармином, при их изучении в световом и электрон­ ном микроскопе не подтверждает существования полухроматид как двух основных элементов митотической хромосомы. Вероят­ нее всего, что полухроматиды, просматриваемые в световом мик­ роскопе, являются продуктом оптической иллюзии.

При изучении окрашенных ацетокармином препаратов мы об­ ратили внимание еще на одно интересное явление. Обычно, тело­ мерные участки анафазных или телофазных хромосом растений, когда хорошо видна их субхроматидная организация, оказывают­ ся замкнутыми. Подобные картины можно видеть почти на каж­ дой фотографии анафазных хромосом, сделанной в световом ми­ кроскопе (см. табл. 20, 33, 34, 35).

На ультратонких срезах анафазных хромосом также видно, что теломерные участки замкнуты и состоят из того же материа­ ла, что и боковые участки хромосом. Так как замкнутость кон­ цевых участков может быть имитирована просто косыми срезами через полую цилиндрическую структуру, необходимо было сде­ лать серийные срезы, чтобы убедиться в том, что исследуется

собственно теломерный участок. На целом ряде таких серий мы убедились, что теломерный участок хромосомы на препаратах, ок­ рашенных ацетокармином, действительно замкнут.

При исследовании ультратонких срезов пыльников Р. arborea, корешков С. capillaris и других объектов после их фиксации в глютаровом альдегиде на поперечных сечениях хромосом в ана­ фазе или ранней телофазе видны кольцевидные структуры (см. табл. 36, 37). Так, например, у Р. arborea (см. табл. 36) в цен­ тральной части поперечно пересеченных хромосом видна зона низкой электронной плотности, структурно резко отличающаяся от остального тела хромосомы (см. табл. 37). В такой централь­ ной зоне, кроме тонковолокнистого материала, как и в окружа­ ющей цитоплазме, встречаются мелкие плотные гранулы, похожие по размерам на рибосомы. Важно отметить, что на поперечном сечении само тело хромосомы имеет небольшие зоны также по­ ниженной плотности. Таким образом, на этих сечениях хромосо­ ма представлена кольцом с широкими стенками, неоднородной композиции. В отличие от ацетокарминовых препаратов стенки кольца в этих случаях значительно толще, центральная светлая зона занимает */4, *А части общего диаметра хромосомы. Часто поперечные сечения хромосом центральных светлых зон не име­

37).

Такую же картину можно наблюдать и у других видов. Так, в центральной части анафазных хромосом Н. katharinae на про­ дольных срезах видно разрыхление, особенно хорошо в зоне те­ ломерных районов (см. табл. 37). На поперечном сечении таких телофазных хромосом также видны центральные светлые зоны.

У объектов с более мелкими хромосомами, таких, как A. fistulosum или V. sativa, подобные светлые зоны в центральных облас­ тях хромосом наблюдать не удалось.

В ряде случаев теломерные участки у хромосом Н. katharinae имеют структуру, очень сходную с той, которая видна на ацето­ карминовых препаратах: хроматиновый материал образует подо­ бие петли. Слепо кончающихся двойных структур типа полухроматид не наблюдалось, что проверено на серии из 20 срезов, прошедших через теломерный участок хромосомы этого вида в

ранней телофазе.

Приведенные выше данные показали, что на поперечном сече­ нии после фиксации спиртом и уксусной кислотой хромосомы большей частью имеют вид колец, а на продольных — вытянутых эллипсов или вытянутых палочковидных структур, в центре кото­ рых располагается зона, лишепная хроматина. Эти данные, а так­

же результаты полной плоскостной реконструкции таких хромо­ сом на серийных срезах показывают, что хромосому на стадии анафазы и телофазы можно себе представить в виде полой цилиндрической структуры. Стенки этого цилиндра образованы хроматиновым материалом, который состоит из отдельных нит­ чатых элементов, что говорит о спиральном типе укладки хромонем в структуре хромосом. Признаки спирализации хромонем в стенке полой цилиндрической структуры достаточно хорошо прослежива­ ются даже на материале, подвергнутом такой грубой обработке, как фиксация спиртом с уксусной кислотой.

Другим не менее важным выводом из наблюдений срезов хромо­ сом после ацетокарминовой обработки, является то, что их теломер­ ные участки построены из того же материала, что и стенки цилин­ дра. Другими словами, хромосомы представляются не в виде открытых полых цилиндров, или трубок, полость которых сооб­ щается с окружающей средой, а в виде замкнутых полых цилин­ дрических структур.

Все эти рассуждения не имели бы под собой почвы, если бы не подтверждались многими наблюдениями с использованием глютарового альдегида в качестве фиксатора. И в этом случае мы находим кольцевидные сечения хромосом, обнаруживаем цент­ ральные зоны разрежения в теле хромосом, также видим замкну­ тость теломерных участков. Поэтому мы считаем, что, несмотря на то, что спирт с уксусной кислотой вносит ряд артефактов, все же этот способ фиксации сохраняет грубую, общую архитектуру хромосомы.

То, что на поперечных сечениях хромосом при глютаральдегидной фиксации толщина колец хромосом больше, чем при ацето­ карминовой окраске, говорит о том, что в последнем случае проис­ ходит сжатие хроматиновых структур. Хроматин кольцевых сече­ ний хромосом при фиксации глютаровым альдегидом выглядит бо­ лее рыхлым и иногда имеет дополнительные светлые зоны, кроме основной центральной. Это может служить признаком дополни­ тельной спирализации хромонем, хотя прямых доказательств в пользу этого у нас нет.

При внимательном анализе литературы мы обнаружили некото­ рые данные, подтверждающие наши наблюдения. Так, Кауфманн и др. (Kaufmann et al., 1960) упоминают о кольцах при поперечном сечении мейотических хромосом. В другой работе (Kaufmann, McDonald, 1956) на приведенных фотографиях с ультратонких срезов хромосом Tradescantia reflexa, окрашенных ацетокармином, видны кольцевидные структуры. Более четкие картины можно найти в работе Лафонтена и Шуинара (Lafontaine, Chouinard, 1963), где авторы после обработки толстых сре­ зов заключенных в метакрилат корешков V. faba проводили реак­ цию Фёльгена. В этом случае поперечные сечения метафазных и

анафазных хромосом имели вид колец, резко окрашиваемых на ДНК, центральные зоны хромосом ДНК не содержали. На ультратонких срезах эти центральные зоны были значительно мень­ ше или не видны вовсе, так как заполнены, по мнению авторов, материалом матрикса, не отличающегося по структуре от хрома­

тина.

Интересно, что в одной из последних работ Байера (Jensen, Bajer, 1969) при изучении митотического аппарата Н. katharinae получены прекрасные электронномикроскопические фотографик продольно рассеченных хромосом, где видны центральные поло­ сти или пустоты точно такого же характера, как на наших препа­ ратах. К сожалению, авторы в этой работе вообще не касаются вопроса о строении хромосом.

Сходные, но менее отчетливые картины можно видеть в работе Барникота и Хаксли (Barnicot, Huxley, 1965), наблюдавших так­ же осевые сердцевины в хромосомах. Таким образом, существует достаточно данных, подтверждающих организацию митотических хромосом в виде полого цилиндра.

Другой вопрос, на обсуждении которого необходимо остано­ виться, это вопрос о структуре теломерных участков хромосом.

Описывая хромосому как полый цилиндр, стенки которого обра­ зованы хроматиновым материалом, мы были вправе ожидать обнаруже­ ния свободных концов субхроматид в теломерах, если бы хромосомный цилиндр был «открытой» структурой.

На самом же деле на срезах ацетокарминовых препаратов мы не смог­ ли видеть двух параллельных сече­ ний стенки цилиндра: на своих кон­ цах эти две параллельные структуры соединялись тем же материалом, из которого образовано тело хромосомы. Благодаря этому возникло представ­ ление о хромосоме как о полом ци­ линдре или трубке с замкнутыми концами (рис. 12). Правильность ука­

128 Судьба компонентов ядра в митоае

костной реконструкции хромосом на серии последовательных сре­ зов (см. табл. 34, 35). Эти данные подтверждаются наблюдениями таких же замкнутостей на материале, фиксированном глютаровым альдегидом (см. табл. 36, 37).

В пользу этого представления можно найти сообщения в ли­ тературе. Главные из них — многие авторы при исследовании вы­ деленных хромосом (Wolfe, Newitt, 1966; Barnicot, 1967; Cole, 1967; Du Praw, 1968) подчеркивают, что в теломерах нет свобод­ ных KOHujB элементарных фибрилл хромосомы, а они всегда образуют петли. Это создает впечатление о продольном зигзаго­ образном способе укладки фибрилл.

Важным подтверждением представления о замкнутости теломер являются фотографии в работе Троско и Вольффа (Trosco, Wolff, 1965) (см. табл. 20), где отчетливо видно, что полухроматиды, а часто и хроматиды на концах имеют петли, т. е. субхроматиды, не обрываются слепо. К сожалению, авторы этот момент оставили без внимания.

Что представляет собой замкнутость хромосомных концов, пока недостаточно ясно. Здесь можно делать только предположе­ ния и искать факты, которые говорили бы в их пользу.

Одно из таких предположений при обсуждении наших данных высказала А. А. Прокофьева-Бельговская, которая считает, что в зоне теломеры гетерохроматиновые участки отдельных хромонем могут слипаться вместе и создавать эту замкнутость концов хро­ мосомы. В пользу этого говорят данные о действительной способ­ ности теломер разных хромосом к слипанию (Yorganian, Рароуан, 1964).

Другое объяснение — это замыкание парных хромонем в зоне теломеры. В результате такого замыкания создается сложная структура хромосомы. Более подробно варианты таких построений будут обсуждены ниже при анализе возможного количества субхроматид в составе хромосомы.

О числе субъединиц (хромонем) в хромосоме

Как видно из приведенных выше наблюдений, электронная микроскопия хромосом не дает точного ответа на вопрос о коли­ честве субхроматид, входящих в состав хромосомы. Поперечные сечения хромосом, окрашенных ацетокармином, представляют со­ бой или сплошные кольца в анафазе, или некое количество пере­ сеченных единиц, располагающихся также в форме кольца. Точ­ ный подсчет этих единиц невозможен, видимо, из-за неспецифи­ ческого слипания хроматина при такой обработке, хотя все же на некоторых препаратах видно, что такие кольца состоят из двух-четырех отдельностей. Поэтому можно попытаться на осно­ вании этих наблюдений воссоздать общую структуру хромосомы,