книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

V I . М А Т Р И К С М И Т О Т И Ч Е С К И Х Х Р О М О С О М

Изучая митотические хромосомы, многие цитологи старой школы видели, кроме хромонемной нити (или нитей), в составе хромосом еще один компонент нехроматиновой природы. Этот компонент обычно описывали в неопределенных терминах, как, например, у Данжара (1950): «Хромонемная нить чаще всего закручена в спираль и заключена в цилиндр из другого вещества, составляю­ щего оболочку, или влагалище, и называемого матриксом». Рис (Ris, 1957) пишет: «Обычно матриксом называют какой-то не со­ держащий генов материал хромосомы, скопляющийся вокруг хро­ мосомной нити, главным образом, во время митоза... Соображения о химическом составе матрикса мы рассматривать не будем, так как в этой области не существует пока ничего, кроме домыслов». Мэзиа (1963): «Что касается морфологических свойств матрикса, то в благоприятных случаях он выглядит как колбасовидное тело, внутри которого заключена закрученная в спираль хромосома...

В отношении своих химических свойств матрикс представляет собой ту часть хромосомы, которая не имеет значения для сохра­ нения целостности первичных генетических нитей и которая мо­ жет изменяться спонтанно, но без нарушения липейной непрерыв­ ности хромосом».

О структурной роли или даже о расположении матрикса были разноречивые мнения. Некоторые авторы считали матрикс осевой структурой, на которой закручивается хромонема, или веществом, которое, следуя за изгибами хромонемы, образует обкладку вокруг хромосомы (Nebel, 1939; Mazia, 1941). По другим представлениям, матрикс образует плотный чехол, вроде оболочки, внутри которо­ го хромонема вынуждена изгибаться (Ileitz, 1935).

Функциональная роль матрикса не была четко установлена. Одни авторы приписывали ему ведущее значение в процессе структуризации и спирализации хромонемы (Serra, 1947, 1949), другие считали матрикс источником образования кариолимфы и ядрышек в телофазе (Nebel, 1932).

Химическая природа матрикса одно время живо обсуждалась. Здесь также существовало несколько точек зрения. По Дарлинг­ тону (Darlington, 1935), хромосома образуется постоянной хромо­ немой, сопровождаемой дополнительными хроматическими веще­ ствами с различным содержанием нуклеиновых кислот. «Нуклеальпость» матрикса определялась тем, что он обладает опреде­ ленной базофилией. По мнению Мэзиа (Mazia, 1941), матрикс,

по-видимому, состоит из белков, содержащих Много кислых групп.

Какого же рода нуклеиновые кислоты создают эту базофилию матрикса, было решено не сразу. Так, Серра (Serra, 1947, 1949) считал, что периферический нуклеопротеин, соответствующий матриксу, состоит из ДНК и гистоноподобных белков.

Введение цитохимических методов определения нуклеиновых кислот сразу же показало присутствие РНК в метафазных хромо­ сомах. Так, Браше (1960) нашел, что при окрашивании метило­ вым зеленым с пиронином по Уина метафазные хромосомы всегда слегка окрашиваются пиронином, а обработка препаратов рибонуклеазой снимает это окрашивание. Сходные наблюдения были сделаны Кауфманном и др. (Kaufmann et al., 1948). Появилась це­ лая серия работ в подтверждение представления о том, что в со­ став матрикса метафазных хромосом входит РНК (Jacobson, Webb, 1952; Lipp, 1953; Boss, 1955).

С другой стороны, появились данные, ставящие под сомнение существование матрикса вообще, а не только как самостоятель­ ную структуру. Так, Рис и Мирский (Bis, Mirsky, 1949) пришли к выводу, что при цитологических методах исследования при фик­ сации происходит сжатие хромосом. Рис (Ris, 1957) считает, что матрикс соответствует зонам, освобождаемым при таком сжатии, что привело его к заключению, что основные данные, свидетель­ ствующие в пользу существования матрикса, основаны на арте­ факте.

В пользу этого говорили наблюдения, что в электронном мик­ роскопе на срезах или на выделенных хромосомах не видно было и намеков на присутствие матрикса или мембраны вокруг хромо­ сом (Ris, 1957; De Robertis, 1956; Kaufmann, McDonald, 1956).

Казалось, что проблема матрикса была решена. На самом же Деле она переросла в проблему «цикла хромосомной РНК» (Мэзиа, 1963). Многие исследователи (за небольшим исключением), занимавшиеся этой проблемой, избегали использовать термин «матрикс».

Как уже было сказано, некоторые исследователи (Nebel, 1932) считали, что роль матрикса заключается в том, что он может слу­ жить источником образования новых ядрышек и ядерного сока в Дочерних ядрах после митоза. Эта точка зрения существует до настоящего времени и имеет множество подтверждений. Однако наблюдения за способностью клеток к синтезу РНК в течение кле­ точного цикла показали, что этот синтез полностью прекращает­ ся, начиная со средней профазы, и начинается в конце телофазы, когда появляются морфологически оформленные ядрышки (Tay­ lor, Woods, 1959; Prescott, Bender, 1962; Swift, 1963). Эти факты Дали основу для представления о том, что ядрышки возникают в

1963). Наряду с этими представлениями существуют наблюдения, говорящие в пользу переноса РНК хромосомами в телофазные ядра. Кусанаги (Kusanagi, 1964) показал, что при коротком вклю­ чении меченного тритием предшественника РНК, уридина и при последующем переносе клеток в нерадиоактивную среду метка может быть обнаружена в зоне метафазных хромосом.

Многочисленны также цитологические наблюдения о переносе материала, близкого по своим характеристикам к ядрышковому материалу, хромосомами во время митоза (Das, 1962; Кикнадзе, 1962).

Используя метод импрегнации ядрышкового материала сереб­ ром, Стокерт и др. (Stokert et al., 1970) показали, что аргентофильное вещество появляется на телофазных хромосомах в виде неболь­ ших предъядрышковых телец. Ингибиторы синтеза белка и РНК не подавляют этот процесс, что говорит о том, что вновь образую­ щиеся ядрышки не синтезировались в профазе, а скорее были перенесены хромосомами по дочерним ядрам.

Электронномикроскопические исследования поведения хромо­ сом в телофазе показали появление на их поверхности или в зонах между тесно расположенными хромосомами элементов, близких но ультраструктуре к ядрышкам (Lafontaine, 1968; Stevens, 1965). Однако авторы считали, что появление этого экстрахромосомного материала связано с возобновлением синтетической ак­ тивности хромосом, так как у метафазных и анафазных хромосом никаких «ядрышкоподобных» или «ядрышковых» структур не обнаруживалось. В своем обзоре Лафонтен (Lafontaine, 1968) приводит дополнительные доводы против происхождения ядрыш­ ка за счет матрикса: при обособлении предъядрышковых структур в телофазе не наблюдается падение плотности хромосом; у расте­ ний с мелкими хромосомами объем предъядрышкового вещества не только заметно больше «матрикса» на хромосомах (при иссле­ довании в световом микроскопе), но даже превышает объем самих хромосом.

Все же перенос метки РНК хромосомами и цитологическое обнаружение нехроматиновых структур в составе хромосом не должны быть сброшены со счетов, они могут указывать на то, что при образовании ядрышек имеют место два процесса одновремен­ но: перенос части материала и возобновление синтеза (Беляева, 1965; Ченцов, 1966; Lafontaine, 1968).

Как можно видеть, главными аргументами против существо­ вания матрикса и его роли в развитии других ядерных структур явились результаты наблюдений митотических хромосом с по­ мощью электронного микроскопа. Действительно, как показано в предыдущих разделах, в профазных, метафазных и анафазных хромосомах не обнаруживается компонентов, отличных от хро­

наблюдать при деспирализации хромосом появление вблизи их поверхности какого-то материала, структурно отличпого от хро­ матина. Такой же материал может быть обнаружен и в метафазных и анафазных хромосомах при их деконденсации с помощью

солей кобальта.

Как уже указывалось выше, разрыхление метафазных хромо­ сом после обработки семян Crepis capillaris 0,2%-ным раствором СоС12 сопровождается обособлением вокруг хромосом вещества, отличного по плотности от хромонемы и от окружающей цито­ плазмы. Этот компонент располагается вокруг хромосом, образуя как бы муфту, стенки которой могут достигать толщины 0,5 мк (см. табл. 38). Это освобождающееся вещество мы относим к хро­ мосомному матриксу старой школы цитологов (Sharp, 1929). Плотность матрикса пиже, чем хромонемы, и поэтому он от нее легко отличим. Матрикс при деспирализации метафазных хромо­ сом с помощью СоС12 располагается не только вокруг хромосом, по и заполняет все промежутки между деконденсированными уча­ стками хромонем. В некоторых случаях матрикс одевает не все участки хромосом или располагается на них неравномерно. Те же картины можно наблюдать и в анафазе.

В метафазных хромосомах объектов, не обработанных СоС12, никаких признаков матрикса не обнаруживается. Хромосома представляется в виде плотного однородного тела.

После обработки СоС12 матрикс выявляется только у метафаз­ ных п анафазных хромосом. Профазные хромосомы в этом случае не проявляют каких-либо изменений по сравнению с контролем. В телофазных ядрах, кроме хромонем, видны предъядрышковые структуры в виде плотных участков фибриллярной природы.

То, что матрикс не является результатом разрушения хрома­ тиновых элементов, а самостоятельной отдельной структурой, под­ тверждается тем, что ни в одной из фаз митоза мы не видели изменений в композиции и структуре хроматиновых элементов клетки. То, что в профазе хромосомы оставались такими же, как в норме, а матриксоподобных структур вокруг них не возникало, говорит о том, что матрикс, видимо, является структурным эле­ ментом хромосом, появляющимся начиная с метафазы.

Выявление матрикса при обработке корешков С. capillaris СоС12 связано с разрыхлением, деспирализацией хромосом под действием этого фактора.

Аналогичные картины обособления матрикса можно наблюдать и при естественной деконденсации хромосом в ранней телофазе. Когда хромосомы уже разошлись к полюсам клеток, только что начали проявлять признаки деконденсации и начала формировать­ ся ядерная оболочка,— в это время у всех без исключения иссле­ дованных видов растений можно обнаружить вокруг хромосом

у С. capillaris (см. табл. 38). В телофазе хромосомы располагают­ ся довольно рыхло, так что отдельные хромосомы лежат на значи­ тельном расстоянии одна от другой, и каждая хромосома окруже­ на как бы облаком матрикса, состоящего из переплетения тонких фибрилл 40—80 А толщиной, между которыми в большом числе лежат рибосомоподобные гранулы диаметром 150—200 А (см.

табл. 38).

Несколько ипая картина проявления матрикса в телофазных хромосомах Paeonia arborea, А. сера, A. fistulosum и Haemanthus katharinae. У этих объектов в телофазе хромосомы располагают­ ся тесными компактными группами. В этом случае вокруг отдель­ ных хромосом в виде тонкого ободка (иногда толщиной не более 0,1 мк) пли между прилежащими хромосомами выявляются зоны меньшей плотности, чем тело хромосомы (см. табл. 38, 39). Эти зоны также представляют собой матрикс хромосом и состоят из переплетепия тонких (40—80 А) фибрилл и скопления рибосомо­ подобных частиц. Можно видеть, что матрикс освобождается не только по периферии таких хромосом, но и между хромонемными участками в толще хромосом, что особенно хорошо впдно в тело­ фазе у Н. katharinae.

По мере прохождения телофазы, после одевания хромосом ядерной оболочкой, в начале стадии реконструкции клеточного ядра, плотные зоны, схожие с матриксом, остаются вблизи хромо­ сом, но их общая композиция несколько изменяется. В это время можно наблюдать скопления участков матрикса в виде крупных или мелких глыбок, чаще всего вблизи хромосом. Создается впе­ чатление, что компоненты матрикса агрегируют. Такие агрегаты состоят главным образом из скопления тонких фибрилл. Вместе с этим в реконструирующихся ядрах появляются светлые зоны, на­ поминающие зоны кариоплазмы (или ядерного сока) в интерфаз­ ных ядрах (см. табл. 47).

Сходные картины можно наблюдать в ранней телофазе при де­ лении клеток культуры почек эмбрионов свиньи (см. табл. 40, 41). В этом случае деления клеток еще не произошло, хромосомы находятся у противоположных полюсов, ядерная оболочка только что начинает закладываться по периферии некоторых хромосом, главным образом, в центромерных районах. На табл. 40 видно, что каждая хромосома как бы окружена муфтой или облаком из вещества с промежуточной плотностью между плотностью хро­ матина и цитоплазмы. Этот матрикс хромосом животпых клеток также состоит из скопления тонких фибрилл и большого числа рибосомных частиц.

Для определения химической природы матрикса мы обраба­ тывали фиксированные клетки рибонуклеазой с последующим воздействием на них трихлоруксусной кислотой. Эта обработка

была предпринята в связи с многочисленными сообщениями ци­ тологов о присутствии РНК в составе митотических хромосом. После обработки ядрышки в контрольных образцах не окраши­ вались пиронином. Оказалось, что такая обработка резко снижала контрастность фибриллярного и гранулярного компонента ядры­ шек и рибосом в цитоплазме. В этом случае резко падает и окрашиваемость матрикса (см. табл. 41). После такой обработки ста­ новятся хорошо различимы контуры хромосом, несущие на своей новерхности многочисленные тонкие (около 0,1 мк) выросты и иногда обнаруживающие хромонемные структуры. Происходит как бы «проявление» внутренней субхроматидной организации телофазных хромосом за счет экстракции матрикса.

Тот факт, что при обработке РНК-азой и ТХУ матрикс ведет себя так же, как компоненты ядрышка и рибосомы, заставляет нас прийти к выводу о том, что в состав матрикса входят рибонуклеопротеины.

Этот вывод прямо подтверждается и при окраске клеток по Бернхарду. При этом резко окрашиваются рибосомы цитоплазмы и ядрышки интерфазных ядер; в ядрышках окрашиваются оба компонента —гранулярный и фибриллярный. В интерфазных ядрах, кроме того, окрашиваются волокнистые структуры ядерного сока и внутриядерные гранулы.

При окраске срезов телофазных хромосом A. fistulosum хро­ мосомы оказываются бледными, неокрашенными. Вокруг них четко выявляется зона контрастно окрашенных гранул и тонких фибрилл, зона, соответствующая матриксу (табл. 42).

Кратко суммируя наши наблюдения за структурой матрикса митотических хромосом, можно сделать следующие выводы:

1.Матрикс, нехроматиновый компонент митотических хромо­ сом, обнаруживается в хромосомах начиная с метафазы.

2.Морфологически матрикс выявляется в условиях естест­ венной (телофаза) или искусственной (при обработке солями кобальта) деконденсации хромосом.

3.Матрикс выявляется в хромосомах как растений, так и

животных.

4. Матрикс состоит из скопления рыхло расположенных тон­ ких фибрилл толщиной 40—80 А и рибосомоподобных гранул.

5. Гистохимические тесты показывают рибонуклеопротепдную природу элементов, входящих в состав матрикса.

Можно дать краткую характеристику матрикса митотических хромосом: это компонент митотической хромосомы растений и животных, освобождающийся при деспирализации хромосом и состоящий из фибриллярных и гранулярных структур рибонуклеопротеидной природы. Такое определение затрагивает, как нам кажется, лишь «статику» материала, не говоря ничего о его про­ исхождении и судьбе.

140 Судьба компонентов ядра в митозе

Сведений о том, что в состав митотических хромосом вообще и в состав их матрикса в частности входит РНК, накопилось доволь­ но много (Браше, 1960; Мэзиа, 1963). Все они были получены ци­ тохимическими методами световой микроскопии.

Электронномикроскопического анализа структуры матрикса, его химизма и поведения в митозе до последнего времени сделано не было. Только в 1968 г. появилось исследование, в котором да­ валось описание электронноплотного компонента, окружающего профазные и телофазные хромосомы А. сера (Peveling, 1968). По мнению автора, которое полностью совпадает с нашими пред­ ставлениями, этот материал соответствует хромосомному матрик­ су. Однако в этой работе не подтвердилось содержание РНК в матриксе на уровне его ультраструктурного анализа. Нам удалось показать, что материал матрикса, содержащий РНК, входит в со­ став хромосом и, по-видимому, располагается не только снаружи хромосомы, но и заполняет промежутки между нитями хромо­ немы.

В последнее время появилось несколько работ о химической композиции выделенных хромосом, которые могут пролить допол­ нительный свет на химизм матрикса.

Развитие методов выделения митотических хромосом позво­ лило получить данные об их составе. Так, Хюберман и Аттарди (Huberman, Attardi, 1966) обнаружили в составе хромосом кле­ ток человека довольно большое количество РНК (0,66 мг на каж­ дый мг ДНК). По данным других работ (Salzman et al., 1966; Maio, Schildkraut, 1967), количество РНК в выделенных хромо­ сомах может составлять в среднем 12—15%. По своей природе это рибосомная РНК. По данным Майо и Шильдкраута (Maio, Schildkraut, 1967), 80% РНК в выделенных хромосомах пред­ ставлены 28S и 16S РНК и около 25% всей РНК находится в виде рибосомных субъединиц 40S и 60S.

Другого мнения придерживается группа Зальцмана (Salzman et al., 1966; Mendelsohn et al., 1968), по мнению которой РНК слу­ чайно связывается с хромосомами в процессе их выделения. В пользу этого говорят их данные о фракционировании хромосом по размерам. Оказалось, что мелкие, медленно седиментирующие хромосомы имеют большее количество РНК и белка (РНК около 12%) на единицу ДНК, чем крупные хромосомы (РНК около 5%).

Несмотря на такие различия в оценке роли РНК в составе митотических хромосом нам все же кажется важным, что в РНК выделенных хромосом входит рибосомная РНК. Это может быть связано с ролью матрикса в цикле хромосомных превращений.

Как уже указывалось выше, одним из первых предположений относительно роли и судьбы матрикса была идея о том, что он может быть источником формирования новых ядрышек и ядерного сока при реконструкции ядер (Nebel, 1939). Однако в по­

структуры на поверхности телофазных хромосом, сходные по сво­ ей тонкой морфологии с элементами ядрышек, представляют собой продукты возобновления синтетической активности хромосом

(Lafontaine, Lord, 1966; Lafontaine, 1968).

Против этого представления есть целый ряд доводов.

То, что хромосомный материал может быть выявлен в стадии метафазы, когда точно установлено отсутствие синтеза РНК, сви­ детельствует против представления о материале матрикса как результате синтеза на хромосоме. Правда, может возникнуть воз­ ражение, что воздействие СоС12 приводит к активации хромосом или к их структурному изменению. Это возражение отвергается наблюдениями, что в профазе общая морфология хромосом не изменяется и что общая структура хромонем и всех клеточных органелл не нарушается. Другим доводом против гипотезы о тело­ фазном матриксе как о продукте возобновленного хромосомного синтеза может быть то, что элементы матрикса отчетливо выри­ совываются в самом начале телофазы, до полного образования ядерной оболочки и первичных ядрышек, т. е. в то время, когда синтез РНК в новых ядрах еще не начинается (Prescott, Bender, 1962). Прямое доказательство участия хромосом в переносе РНКсодержащего материала во время митоза — наши наблюдения за поведением ядрышек при подавлении их синтетической актив­ ности (см. ниже). В этом случае при блокаде синтеза РНК актиномицином в дочерних ядрах все же появляются предъядрышковые структуры, содержащие РНК. Это говорит о том, что хромо­ сомы участвуют в переносе рибонуклеопротеидов в дочерние

ядра.

Сравнение ультраструктур нехроматиновых РНК-содержащих компонентов хромосом, таких, как матрикс митотических хромо­ сом растений и животных, «матрикс» боковых петель мейотических диплотенных хромосом тритона, пуффы политенных хромо­ сом Chironomus, показывает своеобразие этих структур и их раз­ личие в зависимости от функционального назначения.

Так, пуффы политенных хромосом и боковые петли хромосом типа ламповых щеток представляют собой истинные активные участки генома. Интересно, что основной продукт их активности очень схож, несмотря на то, что в одном случае мы имеем дело с насекомыми, а в другом —с амфибиями. У тритона основную массу боковых петель составляют так называемые ординарные петли, которых может быть до нескольких тысяч. «Матрикс» та­ ких ординарных петель содержит РНК и белок и состоит из боль­ шого скопления крупных рибонуклеопротеидных гранул, отли­ чающихся своей величиной (400—600 А) от рибосом.

Полную аналогию с этим наблюдением мы встречаем при изу­ чении различных пуффов на политенных хромосомах. Крупные