книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

имеет небольшое число исключений, которые, как мы видим, толь­ ко подчеркивают важность и необходимость ядрышка в жизнен­ ном цикле клетки. К исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализиро­ вавшиеся, например, некоторые клетки крови.

Количество ядрышек в клетке может меняться, однако их число на ядро зависит от генного баланса клетки (Корас, Mateyko, 1964; Lewis, John, 1963). Было найдено, что в образовании ядры­ шек участвуют определенные места некоторых хромосом, связь которых с ядрышком можно хорошо проследить в телофазе и про­ фазе. Такие хромосомы, как правило, имеют вторичные перетяж­ ки, зоны которых представляют собой места, где идет развитие ядрышек. Мак Клинток (Me Clintock, 1934) назвала эти участки хромосом «ядрышковыми организаторами». Она же показала, что ядрышковый организатор представляет собой не точечный локус хромосомы, а может быть множественным по своей структуре.

Вее экспериментах удалось установить наличие обмена между Двумя хромосомами в микроспороцитах кукурузы, при этом раз­ рыв одной из хромосом проходил через ядрышковый организатор.

Врезультате возникали две хромосомы, каждая из которых несла часть исходного ядрышкового организатора, и обе хромосомы об­ ладали способностью образовывать ядрышки, хотя и не в одинако­ вой степени. Места вторичных перетяжек особенно характерны

Для расположения ядрышковых организаторов, но последние иногда могут располагаться на концах хромосом или в нескольких местах по длине хромосомы.

По данным Тобиаса (Tobias, 1956), общее число ядрышек на ядро определяется числом ядрышковых организаторов и увеличи­ вается согласно плоидности ядра. Интересные факты, подтвержда­ ющие эту закономерность, получены при изучении числа ядры­ шек у мутантных особей шпорцевых лягушек Xenopus laevis (Fischberg, Wallace, 1960). Как оказалось впоследствии (Wallace, 1963), мутация этого вида связана с делецией вторичной перетяж­ ки одной из хромосом, что могло указывать на отсутствие одного ядрышкового организатора. Было найдено, что у гомозиготных мутантных эмбрионов ядрышки вообще отсутствуют, у гетерози­ готных особей всегда имеется только одно ядрышко и один ядрыш­ ковый организатор на геном, у животных дикого типа обычно встречается два или одно ядрышко на клетку.

Однако часто количество ядрышек на ядро бывает меньше чис­ ла ядрышковых организаторов, как, например, в клетках дикого типа X. laevis. Измерения величины ядрышек (Barr, Esper, 1963) показали, что объем одиночных ядрышек равен сумме объемов ядрышек в ядрах с парными ядрышками. Эти наблюдения показы­ вают, что ядрышки могут сливаться; кроме того, в образовании

52 Интерфазное ядро

одного ядрышка могут участвовать несколько организаторов. Так, у амфиплоидных гибридов пшеницы и ржи в ряде случаев в обра­ зовании одного большого ядрышка участвуют несколько хромосом обоих видов (Шкутина, 1966).

Свифт (Swift, 1959) выдвинул предположение о «конкурент­ ных» взаимоотношениях между ядрышковыми организаторами. Еще в работах М. С. Навашина (Navashin, 1934) на гибридах Crepis было показано, что хромосомный локус, который в нор­ мальных условиях образует крупное ядрышко, становится неак­ тивным, когда после гибридизации в ядре появляется более «силь­ ный» локус на другой хромосоме. Те же взаимоотношения отме­ тила Мак Клинток (Me Clintock, 1934) в ядрах микроспороцитов кукурузы.

Тот факт, что в определенных условиях может подавляться активность ядрышковых организаторов или же повышаться ак­ тивность других, бывших до этого в латентном состоянии, указы­ вает на то, что в клетках поддерживается определенный баланс количества ядрышкового материала, или, другими словами, регу­ лируется «валовая» продукция, выдаваемая ядрышками. Однако такая регуляция осуществляется, по-видимому, лишь в диплоид­ ных ядрах. В пользу существования латентных ядрышковых ор­ ганизаторов говорят эксперименты с получением микроядер при облучении или при химическом воздействии на клетки во время митоза. По данным Свифта (Swift, 1959), около 15% микроядер в клетках печени имеют ядрышки, что связано с нахождением в них определенных участков хромосом, ответственных за образо­ вание ядрышек. Однако общее число ядрышек, возникших в мик­ роядрах, выше, чем в исходных клетках; отсюда следует, что не­ которые хромосомы имеют потенциальные ядрышковые локусы, активные в изолированных микроядрах и неактивные в нормаль­ ных клетках. Сходные выводы получены в недавней работе Фил­ липс и Филлипс (Phillips, Phillips, 1969). В работе Н. А. Перова и Ю. С. Ченцова (1971) показано, что в клетках слюнных желез Chironomus plumosus, кроме основного ядрышка, локализованного на четвертой хромосоме, на всех остальных хромосомах встречает­ ся масса микроядрышек, образующих так называемые базофильные диски. Эти микроядрышки ни по ультраструктуре, ни по ре­ акции на актиномицин (см. ниже) не отличаются от основного гигантского ядрышка.

Исходя из перечисленных выше фактов, можно сделать сле­ дующие заключения: образование ядрышек и их число связано с активностью и числом определенных участков хромосом — яд­ рышковых организаторов, которые расположены большей частью в зонах вторичных перетяжек; изменения в числе ядрышек в клет­ ках данного типа могут происходить за счет слияния ядрышек или за счет сдвигов в хромосомном балансе клетки; хромосомы могут

иметь латентные ядрышковые организаторы, активность которых зависит от конкурентных взаимоотношений с «сильными» ядрыш­ ковыми организаторами.

Химия ядрышка

Данные гистохимии и ауторадиографии

По данным гистохимии и ауторадиографии, ядрышко, по сравне­ нию с другими компонентами клетки, характеризуется как самая плотная структура с наиболее высокой концентрацией РНК, с чрезвычайно высокой активностью в отношении синтеза РНК. Так, в клетках спинальных ганглиев плотность ядрышка в три раза выше плотности ядра и в 1,5 раза выше плотности цитоплаз­ мы (Engstrom, 1950). Сухой вес ядрышек может достигать 40— 90% (Vincent, 1955), главным образом, за счет белка. По данным цитохимии, в ядрышках содержатся белки нескольких типов: кис­ лые фосфопротеиды и основные белки негистоновой природы

(Браше, 1960).

Концентрация РНК в ядрышках всегда выше концентрации РНК в других компонентах клетки, хотя вариации в количестве РНК в ядрышках очень значительны. Концентрация РНК в яд­ рышке может быть в 2—8 раз выше, чем в ядре, и в 1—3 раза вы­ ше, чем в цитоплазме (Sirlin, 1962). Так, отношение концентра­ ций РНК в ядре, ядрышке и в цитоплазме клеток печени мыши составляет 1 : 7,3 :4,1; в клетках поджелудочной железы —

1 : 9,6 : 6,6 (Amano, Leblond, 1960). Цитофотометрические иссле­ дования показали, что количество РНК в ядрышках очень велико и колеблется от 2 до 10% на сухой вес. Однако, если учитывать, что объем ядрышек очень мал (несколько кубических микрон), то абсолютное содержание РНК в них мало.

Обычно ядрышко не дает реакции Фельгена, в нем не обнару­ живается ДНК. Все же при исследовании фиксированных клеток вокруг ядрышка всегда выделяется зона хроматина, часто отож­ дествляемая с гетерохроматином ядрышкового организатора. Этот околоядрышковый хроматин, по данным электронной микроско­ пии, представляется как интегральная часть сложной структуры ядрышка (Bernhard, Granboulan, 1968). Ядрышковый хроматин обнаруживается ауторадиографически с помощью меченного три­ тием актиномицина (Ebstein, 1969), путем гибридизации меченой рРНК с денатурированной ДНК на срезах в ооцитах амфибий (Gall, 1969). Многочисленные ауторадиографические исследования показали, что ядрышко — одно из самых активных мест в клетке по включению предшественников в РНК. Так, например, Вудс (Woods, 1960) помещал корешки V. faba в среду с Н3-цитидином на короткое время, в течение которого метились только ядрышки.

Затем после переноса корешков в среду без радиоактивности про­ слеживалось перемещение метки в клетке. Через некоторое вре­ мя метка появлялась в цитоплазме, хотя до перенесения клеток в нерадиоактивную среду ее там не было. Такое перераспределение метки указывает на то, что ядрышковая РНК является предшест­ венником цитоплазматической РНК. К такому же выводу пришли Леблонд и Амано (Leblond, Amano, 1962), изучая на крысах ско­ рость включения Н3-цитидина в РНК ядрышка, ядра и цито­ плазмы.

Пеллинг (Pelling, 1964), исследуя включение Н3-уридина в хромосомы слюнных желез Chironomus, обнаружил, что первые следы включения видны только в области ядрышкового организа­ тора; при большем времени включения метка распространялась по всему ядрышку. Первичное включение Н3-уридина в области яд­ рышкового организатора подтверждает точку зрения о том, что ДНК этого района хромосом ответственна за синтез ядрышковой РНК. Аналогичные данные получили Сирлин и др. (Sirlin et al., 1961). Сходные результаты получены и на клетках высших жи­ вотных. Интересен ряд экспериментов с избирательным подавлени­ ем синтетической активности ядрышка. Перри и Эррера (Perry, Еггега, 1960) использовали тонкий луч ультрафиолетового света для избирательного поражения внутриядерных структур в живых клетках культуры ткани. Как оказалось, поражение участков хроматина не влияет на общий уровень включения метки в РНК ядрышка и цитоплазмы. При облучении ядрышка происходит 90%-ное подавление включения в него Н3-уридина. Если после облучения ядрышек в среду, где растут клетки, ввести Н3-урндин, то через 4 часа количество меченой РНК в ядре и цитоплазме, по сравнению с контролем, резко падает. Оказалось, что при облуче­ нии ядрышка количество метки в ядрах составляет 70% нормы, а в цитоплазме — только 30%. Следовательно, значительная часть меченой РНК, переходящей из ядра в цитоплазму, зависит от синтетической активности ядрышка.

Сходные данные получены при подавлении синтеза РНК с по­ мощью актиномицина. Перри (Perry, 1963) обнаружил, что, ис­ пользуя низкие дозы актиномицина (10~8М), можно избирательно подавлять включение предшественников в РНК ядрышка, тогда как уровень включения в хроматин ядра не изменяется. Одновре­ менно с прекращением включения Н3-уридина в ядрышко пре­ кращается появление метки и в цитоплазме. Как было показано в последующих работах (Perry, 1964), отсутствие метки в ядрышке в этих опытах связано с остановкой синтеза рибосомной РНК.

Прямые данные относительно природы ядрышковой РНК и ее связи с цитоплазматической РНК получены в ряде биохимичес­ ких исследований, особенно при анализе чистых фракций изоли­ рованных ядрышек.

Белки ядрышек

Так как ядрышко является самой тяжелой структурой в ядре, его нетрудно выделить из гомогенатов при центрифугировании. Чтобы получить чистые фракции ядрышек, свободные от приме­ сей, обычно используют дробное центрифугирование гомогенатов ядер в сахарозных растворах (Muramatsu et al., 1963; Birnstiel, Hyde, 1963) или центрифугирование в градиенте сахарозы (Maggio et al., 1963).

Анализы ядрышковых фракций, полученных разными исследо­ вателями, дают довольно сходные данные о количественном со­ держании белка, ДНК и РНК. Так, по данным Бирнстайла и Хай­ да (Birnstiel, Hyde, 1963), отношение белок : РНК : ДНК в ядрах

случае соотношение белок : РНК : ДНК в хроматине было 84: 2 : : 13,5, в ядрышке — 86 : 4 : 10. Очень близкие результаты получе­ ны для ядерных фракций клеток печени и опухолей крыс (Muramatsu et al., 1963).

Первые же анализы белков ядрышковых фракций из ооцитов морской звезды показали отсутствие в ядрышках гистонов (Vin­ cent, 1955). По данным Винсента, большая часть белков ядрыш­ ка представлена фосфопротеидами. Монти и др. (Monty et al., 1956) обнаружили в ядрышках гистоподобный белок. Однако в данном случае этот гистоновый белок мог отражать примесь хро­ матина в ядрышковой фракции, которая содержала много ДНК. Экстрагируя ядерные компоненты солевыми растворами, И. Б. Збарский и Г. П. Георгиев (1959) показали, что в состав ядрышек входит кислый белок, богатый РНК (15—17%).

Бирнстайл и др. (Birnstiel et al., 1964) также использовали со­ левые экстракции и показали, что основной белок ядрышек может включать в себя гистоновый и негистоновый белки. Используя экстракцию в дезоксихолате вместе с ультрацентрифугированием ядрышковых фракций, эти авторы описали четыре фракции яд­ рышковых белков:

1.Фракция белков, не связанных с частицами или осаждае­ мыми компонентами ядрышка, составляет около 7з общего коли­ чества белков ядрышка, хорошо экстрагируется при низких ион­ ных силах растворов.

2.Экстрагируемые рибонуклеопротеиды (РНП) составляют около ‘/з осаждаемых компонентов ядрышка; часть этой фракции содержит типичные рибосомы.

3.Остаточные РНП. Эта фракция сравнительно богата белка­ ми и также представляет около 7з осаждаемых фракций ядрышка.

56 Интерфазное ядро

Ранее этот компонент был идентифицирован в электронном мик­ роскопе как фибриллярный, устойчивый к экстракции 1 и 2М NaCl (Georgiev, Chentsov, 1962).

4. Фракция нуклеогистона, возможно, представляет собо ДНП с осажденного хроматина или ДНП околоядрышкового хро­ матина (ядрышкового организатора).

Из ферментов в ядрышках обнаружены щелочная фосфатаза, нуклеотидфосфорилаза и ДНП-синтетаза (Baltus, 1954). Браше (1960) считает, что одной из возможных функций ядрышек яв­ ляется синтез коферментов. В ядрышках обнаруживаются также РНК-полимераза и ряд ферментов, связанных с синтезом РНК и белка (Sirlin, 1962; Siebert, 1966).

Ядрышки, по-видимому, способны синтезировать белки. Так, выделенные ядрышки проростков гороха могут включать амино­ кислоты in vitro в остаточный, рибосомный белок (Birnstiel, Hyde, 1963). Исследуя способность изолированных ядер к белковому синтезу, Бирнстайл и другие (Birnstiel et al., 1962) нашли, что ядрышко — основное место синтеза белков в ядре. Эти данные подтверждены для ядрышек печени крыс (Rees et al., 1963). Кислоторастворимые белки ядрышек опухолевых клеток самые активные по включению меченого лизина.

РНК ядрышек

Оценивая общее содержание в ядрышковых фракциях белков, РНК и ДНК, можно видеть, что на долю РНК приходится немно­ гим более 10% всей массы ядрышка. Буш и др. (Busch et al., 1963), основываясь на своих исследованиях, считают, что количе­ ство РНК в ядрышке может достигать 5—14%. В клетках пече­ ни, например, содержание РНК в ядрышке составляет только около 4% (Maggio et al., 1963), тогда как в ядрышках пророст­ ков гороха оно доходит до 11% (Birnstiel, Hyde, 1963), а в яд­ рышках опухолей до 20% (Busch et al., 1963).

Большой интерес представляет выяснение природы ядрышко­ вой РНК. Поведение ядрышковой РНК при ауторадиографиче­ ских исследованиях говорило о возможном сходстве ее с РНК цитоплазмы. И действительно, нуклеотидный состав ядрышковой РНК очень близок к составу цитоплазматической РНК, а в неко­ торых случаях идентичен (Maggio еЦа1., 1963).

Так как основную массу цитоплазматической РНК составля­ ет рибосомная РНК (рРНК), то можно сказать, что и ядрышко­

вероятно, из-за того, что РНК ядрышковых фракций сильно дег­ радируют при разрушении ядер и в процессе приготовления пре­ паратов.

В связи с этим большой интерес представляло сопоставление поведения ядрышка и судьбы клеточных РНК в условиях изби­ рательного подавления синтеза РНК. Как уже указывалось выше, Перри (Perry, 1963) заметил, что низкие дозы актиномицина подавляют включение меченых предшественников в РНК ядры­ шек, не влияя на синтез РНК в хроматине. Следующие опыты Перри (Perry, 1964) были связаны с анализом тотальной РНК клеток культуры ткани в условиях подавления ядрышкового син­ теза. В нормальных условиях при кратковременном (около 30 мин.) контакте клеток с Н3-уридином выделенная новосинтезированная меченая РНК при фракционировании ее в сахароз­ ном градиенте распределяется в зонах 35—45 S и 4 S. Если после 30 мин. инкубации с предшественником клетки перенести в не­ меченую среду, то через некоторое время пики радиоактивности перемещаются в зоны 28S и 18S, характерные для рибосомной РНК.

В опытах с предварительным введением в среду актиномици­ на радиоактивности в зоне 35—45 S не появлялось, так же как не появлялась она позже в зонах рибосомной РНК. Если же актиномицин вводить после образования 35—45 S РНК, то переход метки в пики рибосомной РНК происходит. На основании данных этих опытов были сделаны некоторые выводы. Во-первых, новосинтезированная РНК с константами седиментации 35—45 S может представлять собой предшественник РНК рибосом. Во-вто­ рых, прекращение включения Н3-уридина в ядрышковую РНК при действии актиномицина (что показано ауторадиографиче­ ски), совпадающее с отсутствием включения метки в РНК в зоне

рующаяся в ядрышке, представляет собой рибосомную РНК. Аналогичные данные при изучении РНК «хромосомно-яд­

рышкового аппарата» получены Лерманом и др. (1964), которые также пришли к выводу, что ядрышко является структурой, на которой идет синтез рРНК и первые стадии образования рибосом. Сходные результаты о синтезе рРНК были получены на выделен­ ных ядрах (Penman, 1966). Те же самые характеристики име­ ет РНК, выделенная из изолированных ядрышек. Так, Мураматсу и др. (Muramatsu et al., 1966) в изолированных ядрышках печени крыс обнаружили 45 S, 35 S, 28 S и 6S рРНК; при помощи метки и воздействия актиномицином в этой работе было до­ казано, что 45 S РНК синтезируется в ядрышке и там же пере­

ходит в 35 S и 28 S РНК. Сходные данные получены при изуче­ нии РНК в изолированных ядрышках других объектов (Nakamuraiet al., 1967; Muramatsu, 1967; Willems et al., 1968).

Эти. наблюдения перекликаются с данными Брауна и Гэрдона (Brown, Gurdon, 1964), которые показали, что у эмбрионов гомо­ зиготных мутантных особей X. laevis, у которых отсутствуют яд­ рышковые организаторы и нет настоящих ядрышек, полностью отсутствует как синтез 28 S и 18 S рРНК, так и синтез их пред­ шественников (35 S РНК). С другой стороны, у нормальных особей начало синтеза этих рРНК совпадает с появлением ядрышка в клетках эмбрионов в начале гаструляции (Brown, 1964). Сход­ ные взаимоотношения, по-видимому, существуют между появле­ нием ядрышка и образованием рРНК и у других животных.

Подтверждением представлений о том, что ядрышко являет­ ся местом синтеза рРНК и образования рибосом, послужило то, что из ядрышковых препаратов были выделены РНП-частицы, которые как по составу РНК, по седиментационным свойствам, так и по размеру можно охарактеризовать как рибосомы. Они представлены в виде 39S, 60S и 81S частиц, их поведение в раст­ ворах с различной концентрацией магния точно такое же, как у рибосом цитоплазмы (Birnsteil, Hayde, 1963). Эти наблюдения хо­ рошо согласуются с многочисленными данными, полученными при электронной микроскопии ядрышек, в которых были обнару­ жены гранулы тех же размеров и свойств, что и рибосомы (см.

ниже).

Представления о том, что ядрышко служит местом сборки клеточных рибосом или их предшественников, нашли большое число подтверждений. Появились данные, показывающие, что из ядрышек можно выделить гетерогенные рибонуклеопротеидные частицы. Варнер и Соеро (Warner, Soeiro, 1967) изолировали из ядрышек клеток HeLa 80S и 55S рибосомные предшественники, содержащие 45S и 32S рРНК соответственно. Лиау и Перри

(Liau, Perry, 1968) обнаружили 62S, 78S, 95S и 110S частицы в ядрышках, которые содержали рибосомную РНК 28—45S. Эти авторы отмечают более низкую плотность этих частиц по сравне­ нию с цитоплазматическими рибосомами и считают, что при созре­ вании рибосом происходит потеря РНК и белка. Аналогичную схему образования рибосом у животных предлагает Маден (Маden, 1968). В ядрышках происходят переходы новосинтезирован-

ной рРНК: 45S РНК->- 32S PH K ^28S и 18S РНК. Начиная c45S

РНК, белок ассоциирует с рРНК, при этом образуются сначала тяжелые предшественники рибосом (около 80S и 60S), а потом уже и субъединицы рибосом (60S и 40S). Аналогичные данные получены и в других работах. Нараян и Бирнстайл (Narayan, Birnstiel, 1969) выделили из ядрышка частицы 55—80S, из которых 60S частицы были сходны с цитоплазматическими субъедини-

цамн рибосом по РНК, по скорости осаждения в сахарозном гра­ диенте, но отличались большим содержанием белка. В электронном микроскопе ядрышковые 60S частицы были схожи с большими субъединицами цитоплазматических рибосом и с теми гранулами, которые видны в ядрышках на срезах. Такие же данные приведе­ ны и в других работах (Jzawa, Kawashima, 1969). В этих исследо­ ваниях подчеркивается, что ядрышковые рибонуклеопротеидные частицы более рыхлые и крупные, чем цитоплазматические, что может отражать различия в конформации их цепей РНП.

На основании современных данных Перри (Perry, 1969) пред­ лагает схему синтеза рибосом (см. стр. 60).

ДНК ядрышек

Блокада актиномицином синтеза рРНК указывает на то, что по­ следний должен осуществляться на матричной молекуле ДНК (Franklin, Baltimore, 1962). Биохимическими исследованиями об­ наружено в выделенных ядрышках определенное количество ДНК, которую можно отождествить с околоядрышковым хроматином или с ядрышковыми организаторами хромосом. Содержание ДНК в выделенных ядрышках составляет 5—12% от сухого веса (Busch et al., 1963) и 6—-17% от всей ДНК ядра (Me Leish, 1964).

Интересно было узнать, является ли эта ядрышковая ДНК спе­ цифической матрицей для синтеза рРНК или же это участки хро­ мосом, регулирующих работу ядрышка, а матричная рДНК распо­ лагается где-либо в других участках хромосом. Об этом можно было бы судить по нуклеотидному составу ядрышковой ДНК, так как ДНК, на которой синтезируется рРНК, должна обладать высоки]' содержанием гуанина и цитозина но сравнению с ДНК остального хроматина.

Однако прямой анализ нуклеотидного состава ДНК ядрышко­ вых фракций показал, что эта ДНК богата аденином и тимином, что характерно для основной массы ДНК (Busch et al., 1963). Та­ кой негативный результат не мог быть признан окончательным из-за возможности больших примесей соосажденного хроматина пли, наоборот, из-за потери части ядрышковой ДНК.

Другой прием для характеристики ядрышковой ДНК примени­ ли Збарский с сотр. (1964). Было замечено, что при экстракции ДНП из ядер 1,5 М раствором NaCl в последнюю очередь экстраги­ руются гетерохроматиновые околоядрышковые участки. Оказалось, что в экстрагированной части хроматина отношения пар нуклеоти­ дов Г+Ц : А + Т были равны 0,73, а в неэкстрагированной части приближались к значениям 0,93—1,24 (для рРНК отношение Г+Ц : А +У равно 1,5). Возможно, эти данные указывают на от­ личие ядрышковой ДНК от ДНК хроматина ядра и на гетероген­ ность этой ДНК. Повышение коэффициента специфичности этой