книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

0s04.

Значительные изменения структуры элементарных хромосом­ ных фибрилл происходят при действии заведомо хелатных соеди­ нений, таких как ЭДТА или цианиды, как это впервые показано Рисом (Ris, Chandler, 1963).

Действительно, при добавлении к растворам ДНП ЭДТА в концентрации 1 -10 —2 М можно видеть, что большую часть препа­ рата составляют тонкие фибриллы (100 А), которые кажутся не только вдвое тоньше исходных, но и гораздо прямее их (табл. 3). Иногда видно, что отдельные фибриллы толщиной 100 А идут на некоторых расстояниях параллельно друг другу, иногда они располагаются попарно. Однако большей частью фибриллы лежат независимо, переплетаясь в различных направлениях. Мы не смо­ гли наблюдать расщепление одной фибриллы толщиной 250 А на две спирально скрученные субъединицы, как указывал Рис. Пар­ ное расположение фибрилл толщиной 100 А, на наш взгляд, яв­ ляется случайным и поэтому не может служить доказательством многонитчатости основной фибриллы, имеющей толщину около

200 А.

Подобное же изменение толщины фибрилл можно вызвать другим агентом, связывающим двувалентные катионы и давно используемым для разрыхления ядерных структур и хромосом,— цианистым калием. Добавление к растворам ДНП KCN в концент­ рации 0,02—0,002 М приводит к уменьшению диаметра фибрилл хроматина до 100 А. Те же картины можно получить и в целых клетках корешков растений при инкубации их в растворах с хе­ латными агентами (ЭДТА или KCN).

Таким образом, два различных вещества, ЭДТА и KCN, обла­ дающие свойством связывать двувалентные катионы, вызывают сходные морфологические изменения в ультраструктуре элемен­ тарных хромосомных фибрилл! Это может служить подтвержде­ нием очень важной роли двувалентных катионов в поддержании общей структуры хроматина (Steffensen, 1960) и одновременно должно настораживать при анализе тех работ, где ЭДТА исполь­ зуется при выделении ДНП.

Резкие структурные изменения происходят с фибриллами ДНП при повышении ионной силы растворов.

Известно, что обработка ядер или хроматина высокими кон­ центрациями NaCl (1—2 М) приводит к растворению хроматина в результате его диссоциации на белок и ДНК (Pollister, Mirsky, 1946). Постепенное повышение концентрации соли в растворе приводит к последовательной диссоциации нуклеогистонового комплекса, что в свою очередь вызывает уменьшение толщины ис­ ходных фибрилл ДНП (Георгиев и др., 1967) и увеличение мат­ ричной активности хроматина (Боннер, 1967).

изучения препаратов ДНП, нри постепенном повышении концен­ трации NaCl в растворе первые изменения в толщине и конфигура­ ции фибрилл начинают обнаруживаться в растворах 0,4 М NaCl и особенно отчетливо в 0,6 М растворах. При этом фибриллы ДНП утоньшаются, их диаметр колеблется от 100 до 40—50 А. Меняет­ ся их пространственная композиция. Если в исходных раство­ рах с низкой ионной силой фибриллы ДНП имели извитой харак­ тер, то теперь они выглядят сильно вытянутыми, идущими непре­ рывно на большом расстоянии (табл. 3). Иногда на их поверхно­ сти видны мелкие гранулы, придающие фибриллам четковидный характер.

Дальнейшее повышение концентрации соли в растворах NaCl (0,8—1,5 М) приводит к преобладанию в препаратах нитей тол­ щиной 30—40 А, также располагающихся главным образом пря­ молинейно.

Очевидно, в данном случае наблюдается структурный переход от плотных сильно изогнутых и перевитых фибрилл с толщиной 200 А к фибриллам меньшего диаметра, вытянутым и более рас­ прямленным. Этот переход связан с потерей белка.

Было замечено (Сенченков, Манамшьян, 1970), что при соле­ вой экстракции фибрилл ДНП, нанесенных на подложку, их дис­ социация происходит не полностью. Под электронным микроско­ пом видно, что в таком препарате, обработанном 2 М раствором NaCl, содержатся участки практически не измененных фибрилл толщиной около 200 А одновременно с тонкими фибриллами. Это наводило на мысль, что при обработке солевыми растворами не весь препарат подвергается диссоциации, а только, по-видимому, та часть, которая не прикреплена к формваровой подложке и до­ ступна для воздействия NaCl. В таких случаях видны практиче­ ски все переходы от фибрилл толщиной 200 А до тонких фибрилл толщиной 20—40 А.

Короткая экстракция солевыми растворами путем быстрого прикасания препарата ДНП к поверхности 2 М раствора NaCl с последующей быстрой фиксацией в формалине дала новые инте­ ресные результаты при использовании негативного контрастиро­ вания препаратов водными растворами уранилацетата или фос­ форновольфрамовой кислоты.

На некоторых препаратах видно разворачивание толстых (200 А) фибрилл (табл. 4). При этом в их составе обнаруживается одна фибрилла толщиной около 100 А, уложенная в виде крутой спирали.

В экспериментах по воздействию растворами высокой ионной силы на ДНП особенно видно изменение толщины фибрилл в про­ цессе экстракции и изменение их общей формы. Действительно, если в исходных растворах фибриллы имели изогнутый, извитой

ной силы растворов, не меняя конформации нуклеогистоновых фибрилл, ведет к их расталкиванию, видимо, за счет одноименных отрицательных зарядов на их поверхности, что позволяет обо­ собляться отдельным фрагментам или частицам ДНП в составе выделенных препаратов. Это приводит к получению «растворов» ДНП в деионизированной воде. Повышение концентрации одно­ валентных катионов до 0,05—0,15 М вызывает агрегацию отдель­ ных фибрилл за счет экранировки отрицательных зарядов гисто­ нов и выпадение ДНП в осадок. К такой же агрегации приводит и добавление низких концентраций двувалентных катионов

Длина ДНП11 ■tO3'А

Mg2+ и Са2+ (0,01 М), которые могут благодаря сшивкам отдель­ ных групп гистонов также вызывать структуризацию хроматина

и выпадение его в осадок.

Определенный вклад в процесс структуризации хроматиновых фибрилл могут вносить слабые взаимодействия типа водородных связей и гидрофобные взаимодействия между белковыми компо­ нентами ДНП как на поверхности одной, так и между разными макромолекулами. Так, по данным Георгиева и др. (1970), до­ бавление к препаратам ДНП мочевины, разрушающей водород­ ные связи и влияющей на гидрофобные взаимодействия, вызы­ вает растворение препаратов ДНП без потери белка. Это растворе­ ние, по-видимому, связано со структурными изменениями внутри исходных фибрилл ДНП, которые переходят в тонкие фибриллы диаметром около 40 А. С другой стороны, удаление из препаратов ДНП двувалентных катионов приводит также к уменьшению ди­ аметра фибрилл и облегчает процесс перехода ДНП в растворимое состояние. При этом удаление Mg 2+ и Са2+- может приводить к разрыву сшивок между отдельными молекулами или между от­ дельными участками одной и той же молекулы. Даже частичная

диссоциация белка, главным образом лизиновых гистонов, при­ водит к солюбилизации препаратов ДНП, сопровождающейся уменьшением диаметра фибрилл. Дальнейшее удаление гистонов приводит к все большему уменьшению толщины хроматиновых фибрилл, вплоть до 25 А (толщина молекул ДНК) при полном удалении гистонов. Схематически такое поведение элементарных хроматиновых элементов, входящих в состав нуклеогистонов, представлено на схеме (рис. 2).

Все эти представления закономерно подводят нас к вопросу о способах укладки ДНК в составе хроматиновых фибрилл. Как уже показано, по этому вопросу существует большая литература, базирующаяся, главным образом, на рассуждениях и теоретиче­ ских расчетах. Тем не менее мысль о сверхскручивании ДНК в составе хроматиновых фибрилл появилась давно (Bopp-Hassen- kamp, 1959). По-видимому, идея о нескольких порядках сверхспирализации, сверхскручивания в укладке ДНК в структуре фиб­ риллы ДНП правильна. На самом деле увеличение длины отрез­ ков ДНП после удаления из них гистонов трудно объяснить иначе, как результатом распрямления изогнутых при спирализации структур, содержащих ДНК. В пользу этого говорят и рас­ четы длины молекул ДНК по сравнению с длиной хромосом. Кро­ ме того, с помощью электронной микроскопии показано существо­ вание нескольких уровней организации элементарных фибрилл, что выражается в существовании нескольких классов толщины фибрилл ДНП. Это нативные фибриллы в составе хромосом и ядер толщиной около 200—250 А; это фибриллы толщиной около 100 А, возникающие при действии хелатов или солей, экстрагиру­ ющих часть гистонов. При частичной экстракции гистонов в рас­ кручивающихся фибриллах ДНП толщиной 200 А видна спираль­ ная укладка более тонких фибрилл.

Второй порядок сверхскручивания или укладки в составе фи­ брилл толщиной 100 А также может быть определен электронномикроскопически. Так, Рис (Ris, 1967), обрабатывая такие фи­ бриллы, полученные из ядерных эритроцитов в присутствии хела­ та (цитрат натрия), проназой после полного удаления белков видел нить ДНК, которая образовывала многочисленные зигзаго­ подобные изгибы и короткие петли. По мнению этого автора, такая изогнутая молекула ДНК в сочетании с белком дает фибриллу со средней толщиной 100 А.

Брам и Рис (Bram, Ris, 1971) на основе электронной микро­ скопии и изучения ДНП методом рассеивания рентгеновских лу­ чей под малыми углами приходят к заключению, что фибрилла ДНП (в препарате, полученном в присутствии ЭДТА) содержит одну нативную молекулу ДНК, которая нерегулярно сверхспирализована или изогнута со средним шагом в 45 А, образуя более тол­ стую фибриллу.

2*

В пользу представления о сверхслирализации ДНК в составе фибрилл ДНП, выделенных по Зюби и Доти, говорят данные рентгеноструктурного анализа (Pardon, Wilkins, 1972; Pardon, 1970), показавшего, что шаг вторичной спирали имеет размер в 120 А и диаметр около 100 А (рис. 3).

Удаление значительной части белка, по-видимому, приводит к полному разворачиванию хроматиновой фибриллы, толщина кото­ рой может колебаться от 40 до 60 А.

Таким образом, в составе фибрилл ДНП можно предполагать существование двух уровней сверхскручивания молекулы ДНК. Степень естественного раскручивания фибрилл ДНП может ото­ бражать способность их к участию в синтезе РНК. Следовательно, в метаболически активных ядрах должны быть видны фибриллы с промежуточной степенью структуризации, которые можно было

бы считать активными. Так, Голл (Gall, 1966) высказал предполо­ жение, что более тонкие фибриллы, встречающиеся в интерфазных ядрах, могут представлять собой функционирующие участки хро­ мосом. Дю Про (Du Praw, 1968) также считает, что тонкие фиб­ риллы типа А (толщиной 35—60 А) представляют собой первый порядок сверхскручивания ДНК в активных участках хроматина, а фибриллы типа В (200 А) — второй порядок сверхскручивания (.спиральная спираль) в гетерохроматине. Гриффит (Griffit, 1970) полагает, что фибриллы толщиной около 30 А могут быть актив­ ными участками генома. К сожалению, прямых доказательств этих возможностей в настоящее время нет.

Не вызывает сомнений, что ДНК, находясь в сверхскрученном состоянии в составе фибрилл ДНП, может претерпевать дополни­ тельную укладку уже в составе хромосомы. Интересно, что и в этой дополнительной сверхструктуризации большую роль играют также гистоны, богатые лизином. Так, удаление лизинового ги­ стона приводит к диссоциации конденсированного хроматина в ядрах тимуса (Littau et al., 1965), добавление лизинового гистона к депротеинизированным хромосомам восстанавливает их общую морфологию (Mirsky et al., 1968).

Организация хроматина в интерфазном ядре

В предыдущих разделах, давая характеристику хроматина, мы рас­ сматривали только общие свойства хроматина, его общую хими­ ческую и структурную организацию, как бы отвлекаясь от одного из важных вопросов — как же хроматин организован в интактном пнтерфазном ядре. Другими словами, мы избегали говорить о том, есть ли какая-либо специфика в пространственном расположении хроматина, в его структуре, в его изменениях в жизненном цикле клетки, т. е. существуют ли какие-то структурные принципы в ор­ ганизации хроматина в ядре. Более коротко эти вопросы можно свести к одному: как организована хромосома во время ее фун­ кционирования. При постановке этого основного вопроса на па­ мять приходит огромное число исследований, посвященных политенным хромосомам. Мы не будем здесь касаться этой темы и отсылаем читателей к прекрасной монографии И. И. Кикнадзе «Функциональная организация хромосом» (1972), где рассматри­ ваются все известные на сегодня свойства политенных хромосом, которые можно принять за модель интерфазной хромосомы. Ни в коем случае не умаляя значения структуры и функции политен­ ных хромосом, более того, используя данные об их свойствах, мы все же интересуемся вопросом о том, как организована функцио­ нирующая хромосома в обычных соматических ядрах. К сожале­ нию, сведений об организации хромосом в интерфазных ядрах очень мало и они неоднозначны.

Хромосомы сохраняют свою индивидуальность в интерфазе

К. Белар (1934), формулируя теорию индивидуальности хромосом, одним из основателей которой был Бовери (Boveri, 1909), считал, что хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра в телофазе, сохраняются в нем хотя бы в значительно измененном виде в ка­ честве самостоятельных индивидуумов и во время интерфазы, и выяляются снова как морфологические единицы в следующей профазе. Таким образом, хромосомы сохраняют свою структурную и генетическую индивидуальность в течение всего жизненного цикла. В пользу структурного постоянства хромосомных элемен­ тов в интерфазных ядрах говорит целый ряд прямых наблюдений.

Так, Бовери (Boveri, 1909) показал, что во время дробления бластомеров аскариды при переходе от телофазы к интерфазе на месте длинного плеча хромосомы появляются лопасти ядра, в ко­ торых в последующей профазе вновь возникает то же плечо хро­ мосомы. Эти наблюдения в дальнейшем были подкреплены мно­ гочисленными наблюдениями соответствия в расположении хро­ мосом, скрывающихся от наблюдателя при переходе от телофазы к интерфазе и появляющихся вновь в том же ядре в ближайшей профазе (Белар, 1934). При этом повторяется общий порядок (поляризапия) в расположении хромосом: теломерные участки хромосом располагаются на одном полюсе ядра, центромерные — на ттпугом, как в телофазе.

После деконденсации хромосом в интерфазе в ядре обычно уже не удается выявить хромосомы как структурные индивиду­ альности. Но за последние годы найдены объекты и приемы, по­ зволяющие следить за хромосомами или их специфическими участ­ ками и в интерфазе.

Морфологическая сохранность хромосом в интерфазном ядре хорошо прослеживается на примере половых хромосом. Б первую очеретть это относится к Х-хромосоме некоторых млекопитающих, сохраняющейся у самок в течение всей интерфазы в конденсиро­ ванном состоянии (тельце Барра) (Вагг, 1966) (см. табл. 5). В интерфазном ядре можно наблюдать с помощью флюоресцент­ ных методов гетерохроматизированную Y-хромосому (Pearson et al., 1970). Положение половых хромосом в интерфазном ядре изучалось также методом авторадиографии. В ряде случаев ДНК половых хромосом синтезируется в конце S-периода клеточного цикла. С использованием меченого предшественника ДНК в тот момент, когда его включение идет только в Y-хромосому, показано, что в спепматогониях кузнечика (Taylor, 1964) и крысы (Bianchi. Bianchi, 1969) метка располагается над ядром только локаль­ но па всех стадиях развития сперматогоний. Радноаутографическй

хромосом человека, участвующих в образовании ядрышка (Ohno et al., 1961).

Все эти данные говорят о том, что в интерфазном ядре хромо­ сомы сохраняют свою морфологическую индивидуальность хотя бы потому, что они занимают определенные зоны и объем интер­ фазного ядра.

В пользу этого также говорят наблюдения Онищенко и др. (1972), показавших, что если клетки культуры ткани китайского хомячка или корешков проростков Vicia faba предварительно ин­ тенсивно пометить Н3-тимидином, а потом дать клеткам много­ кратно разделиться в среде, не содержащей радиоактивного пред­ шественника, то параллельно с общим падением радиоактивности ядер за счет синтеза немеченой ДНК изменялась локализация метки в ядре. Если сразу после контакта с Н3-тимидином метка равномерно заполняла все ядро, то после нескольких последующих делений зерна серебра располагаются над ядром в виде локаль­ ных групп, число которых тем меньше, чем больше прошло кле­ точных делений (см.табл. 5).

Наряду с такого рода наблюдениями существует масса косвен­ ных данных, говорящих не только о том. что в интерфазном ядре отдельные хромосомы сохраняются как отдельные единицы, хотя и в сильно деконденсированном состоянии, но и о том, что в интерфазном ядре расположение хромосом не хаотично, а строго упо­ рядоченно. Так, М. С. Навашин (1947) показал повторение поряд­ ка в расположении хромосом в метафазных пластинках в ряду клеточных делений у Crepis capillaris. Существует много наблюде­ ний о неслучайном расположении хромосом в метафазных плас­ тинках (см. обзор Будякова и Золотарева, 1971), о неслучайном образовании дицентрических хромосом при облучении интерфазпых ядер (Бочков и др., 1970) и т. п.

Нам представляется, что даже это краткое перечисление основ­ ных фактов позволяет прийти к общему выводу о том, что интер­ фазное ядро представляет собой строго организованную сложную структуру, а не просто бесструктурный гомогенный пузырек, как его можно видеть при наблюдениях in vivo.

Данные классической цитологии о сходстве общего характера в расположении хромосом в телофазном и профазном ядрах дают основание предположить, что и в интерфазе, несмотря на почти пол­ ную деконденсацпю хромосом, несмотря на их «растворение», сле­ дует в ядре ожидать порядка в их ориентации, сходного с тело­ фазным расположением хромосом. Действительно, в ряде случаев Удается в интерфазном ядре наблюдать отдельные специфические участки хромосом, располагающиеся довольно закономерно. Так Данжар (Dangeard, 1937), классифицируя разные типы ядер рас­ тительных клеток, описал так называемые «ядра с колпачками».

40 Йнтерфазное ядро

Для этих ядер характерно, что отдельные участки конденсирован­ ного хроматина, хромоцентры, собраны на одном из полюсов на периферии ядра. Данжар, исходя из совпадения числа хромосом и хромоцентров, высказал предположение о центромерном проис­ хождении последних. Фокс (Fox, 1966) показал, что при включе­ нии Н3-тимидина в центромерные участки хромосом у Schistoсегса grearia метка над интерфазным ядром занимает небольшую ограниченную площадь. Интересны наблюдения Фассел (Fussell, 1972), которая с помощью радиоавтографии показала, что у кле­ ток проростков корешков А. сера одна из зон интерфазного ядра занята, по всей вероятности, хромоцентрами центромерного проис­ хождения, тогда как на противоположной части ядра расположе­ ны многочисленные (12—14) теломерные участки хромосом. Эти данные также говорят о неслучайном расположении хромосом в интерфазном ядре, порядок расположения которых повторяет те­ лофазную ориентацию хромосом после деления ядра. Не лише­ но интереса предположение А. Н. Мосолова (1972) об универ­ сальности центромерного закрепления хромосом в интерфазных ядрах.

Полярность в расположении хромоцентров характерна для тело­ мерных районов у некоторых объектов. Так, Павулсоне и Иордан­ ский (1971) показали ауторадиографически, что все хромоцентры интерфазных ядер клеток меристемы Allium fistulosum представ­ ляют собой не что иное, как теломерные участки. Подробный ана­ лиз этих структур с помощью электронного микроскона на сериях ультратонких срезов (Онищенко, Ченцов, 1971) показал, что все такие теломерные хромоцентры (кроме одного, связанного с ядрыш­ ком) располагаются на периферии интерфазных ядер в тесном кон­ такте с ядерной оболочкой. Такой характер расположения теломер­ ных хромоцентров остается неизменным, начиная от телофазы и кончая профазой (табл. 6). Однако их локализация при этом не­ сколько меняется. В поздней телофазе все периферические хромо­ центры сосредоточены на теломерном полюсе ядра, и эта зона занимает около половины поверхности ядра. В двух дочерних яд­ рах на этой стадии обнаруживается зеркальное расположение хро­ моцентров. В клетках на стадии G2 также сохраняется такая по­ лярность в расположении теломерных хромоцентров, хотя свободная от них зона становится значительно меньше. Можно предполагать, что эти свободные от хромоцентров зоны должны представлять со­ бой области интерфазного ядра, занятые центромерными участка­ ми. Необходимо отметить, что в зоне теломер, помимо четко выра­ женных хромоцентров, всегда встречается большое количество хроматинового материала, связанного с ядерной оболочкой, так же как и в зоне, свободной от хромоцентров.

Если пространственная локализация хромосомных элементов в интерфазном ядре уж достаточно доказана, то пока совершенно