книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

ДНК до 1,24 отражает обогащение околоядрышкового хроматина участками, богатыми Г- и Ц- основаниями.

Как известно, с помощью метода гибридизации РНК с ДНК было показано на бактериях (Spiegelman, Yankofsky, 1965), расте­ ниях (Chipchase, Birnstiel, 1963) и насекомых (Ritossa, Spiegel­ man, 1965), что около 0,3% ДНК этих организмов имеют нуклео­ тидную последовательность, комплементарную к рРНК и, следова­ тельно, определяющую состав этих РНК. Были предприняты по­ пытки анализировать этим методом локализацию матричной ДНК для синтеза рРНК.

В одной из работ объектом служили хорошо изученные в гене­ тическом и биохимическом отношениях шпорцевые лягушки X. 1аevis (Wallace, Birnstiel, 1966), на которых изучалась способность ДНК гибридизироваться с меченой рРНК этих животных. Для этого были использованы ДНК из животных дикого типа, имею­ щих два ядрышковых организатора, ДНК из гомозиготных му­ тантов, лишенных ядрышковых организаторов и неспособных об­ разовывать нормальные ядрышки, и ДНК из гетерозиготных осо­ бей, обладающих только одним организатором ядрышка. Гибриды рРНК — ДНК отделялись от некомплексированной денатуриро­ ванной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Как оказа­ лось, самый высокий процент связывания рРНК с ДНК был у животных дикого типа, имеющих два ядрышковых организатора; комплексирование у безъядрышковых особей было очень низким, а у одноядрышковых занимало промежуточное положение (57% по сравнению с диким типом). Отсюда следует, что ДНК ядрыш­ кового организатора является той самой ДНК, на которой проис­ ходит синтез ядрышковой, т. е. рибосомной, РНК. На основе ана­ лиза насыщения ДНК при гибридизации с рРНК в этой работе делается также вывод о том, что цистроны, отвечающие за синтез рРНК, располагаются компактно и, возможно, представлены в виде полицистронного участка, входящего в состав ядрышкового ор­ ганизатора. Бирнстайл и др. (Birnstiel et al., 1966), анализируя уровень насыщения для рРНК, пришли к выводу, что на гаплоид­ ный геном приходится 500—800 комплементарных участков ДНК для каждой 28S и 18S рРНК.

В другой работе (Ritossa, Spiegelman, 1965) исследовалась ДНК из особей нормальных и мутантных линий дрозофилы с раз­ личным числом ядрышковых организаторов — от 1 до 4. В диком типе дрозофилы самцы и самки имеют по два ядрышковых орга­ низатора, самцы линии G-1 — только один, самцы линии G-31 — три, а при сложной гибридизации G-31 с диким типом можно по­ лучить самок с четырьмя ядрышковыми организаторами. Из осо­ бей этих четырех линий выделялась ДНК и исследовалось ко­ личество меченой рРНК, которая образовывала комплексы с ДНК. У ДНК одноядрышковых особей процент специфического

62 Интерфазное ядро

связывания с рРНК составлял 0,15%, у двухъядрышковых (дикий тип) — 0,27, у трехъядрышковых — 0,42, у четырехъядрышко­ вых — 0,54%, т. е. получена прямая зависимость количества связы­ вания меченой рРНК с ДНК из разных источников, соответственно их генетической конституции, и показано, что вся ДНК, компле­ ментарная рРНК, локализуется в ядрышкообразующем локусе хро­ мосом. Эти работы говорят о том, что в геноме клеток X. laevis и Drosophila ядрышковая ДНК представлена серией однозначных рибосомных цистронов. Возник вопрос, не отражает ли такая полицистронность результат временной активации синтеза рРНК. Ритосса и др. (Ritossa et al., 1966) показали на цыплятах, что клетки с низким уровнем синтеза рРНК (ядерные эритроциты и спермин) имеют такое же количество рДНК, как и клетки, активно синтези­ рующие рРНК (около ста рибосомных цистронов).

В последнее время решен вопрос о природе дополнительных ядрышек в ооцитах амфибий (Brown, Dawid, 1968; Macgregor, 1968; Gall, 1968; Birnstiel et al., 1969). Оказалось, что многочис­ ленные (более 1000) ядрышки ооцитов представляют собой истин­ ные ядрышки, возникшие в результате отделения от хромосом ядрышковых организаторов, функционирующих как дополнитель­ ные матрицы для синтеза рРНК. Это объяснило полученные при наблюдениях данные о том, что в ядрах ооцитов X. laevis содер­ жится в 1400—2000 раз больше рДНК, чем в соматических ядрах (Wallace, Birnstiel, 1966). В частности, Миллер с помощью элек­ тронного микроскопа (Miller, 1966, 1967; Miller, Beatty, 1969)

установил, что центральная фибриллярная зона дополнительных ядрышек содержит одну циркулярную молекулу ДНК, покрытую «матриксом» из РНК. «Матрикс» имеет вид сегментов (4—5 ми), длина которых соответствует длине цистрона рДНК для синтеза молекул предшественников рРНК. Этот «матрикс» состоит из мно­ гочисленных РНП-фибрилл, одним концом связанных с осью ДНК; в каждом цистроне рДНК одновременно синтезируется около 100 молекул рРНК.

Таким образом, биохимические исследования ядрышка показа­ ли, что в них происходит синтез рРНК на матричных ДНК ядрыш­ ковых организаторов. В ядрышке же, видимо, происходит и ассо­ циация рРНК с рибосомными белками. Все эти наблюдения позво ляют говорить о том, что ядрышко является местом синтеза кле­ точных рибосом.

Ультраструктура ядрышка

Данные о биохимическом составе ядрышек позволяют подойти к пониманию морфологических особенностей структуры этого орга­ ноида в зависимости от его функционального состояния.

При изучении большого числа различных клеток животных и растений отмечена волокнистая или сетчатая структура ядрышек, заключенная в более или менее плотную диффузную массу. Эту во­ локнистую структуру можно видеть в световом микроскопе на ок­ рашенных специальными методами препаратах и в живых интакт­ ных клетках. Эстабле и Сотэло (Estable, Sotelo, 1951) предложили названия для этих частей: волокнистая часть — «нуклеолонема» (pars nucleolonema) и диффузная, гомогенная часть — «аморфное вещество» или «аморфная часть» (pars amorpha). Оба эти участка ядрышка Фёльген-отрицательны. Сделанные почти одновременно с этим'электронномикроскопические исследования также выявили волокнисто-нитчатое строение ядрышек (Bernhard et al., 1952).

Однако такое нитчатое строение ядрышка не всегда четко вы­ ражено (Bernhard, 1966). У некоторых клеток отдельные нити нуклеолонем сливаются и ядрышки могут быть совершенно однород­ ными, как, например, в клетках карциномы Эрлиха.

Яри более пристальном изучении ядрышка можно заметить, что основные структурные компоненты ядрышка — плотные гра­ нулы диаметром около 150 А и тонкие фибриллы толщиной 40— 80 А. Пространственная композиция этих основных компонентов ядрышка и дает весь небольшой ряд его структурных модифика­ ций. Во многих случаях (ооциты рыб и амфибий, меристематические клетки растений) фибриллярный компонент собран в плотную центральную зону (сердцевина), лишенную гранул, а гранулы за­ нимают периферическую зону ядрышка. Между гранулами в этой зоне всегда наблюдаются рыхло расположенные фибриллы толщи­ ной 40—80 А. В ряде случаев (например, клетки корешков расте­ ний) в этой гранулярной зоне не наблюдается никакой дополни­ тельной структуризации. Но часто эта зона представлена обособлен­ ными нитчатыми структурами толщиной около 1500—2000 А, состо­ ящими из гранул и рыхло расположенных фибрилл. В данном слу­ чае эти нитчатые гранулярные периферические компоненты яд­ рышка соответствуют нуклеолонеме, а центральная фибриллярная часть — аморфной части. Фибриллярная часть ядрышка также не всегда собрана в компактную центральную зону. Например, в яд­ рышках печени, .кишечного эпителия, клеток хряща мышей фиб­ риллярные участки без особого порядка разбросаны среди грану­ лярных, нуклеолонемных, участков ядрышка (рис. 5, табл. 13).

Кроме этих двух компонентов ядрышек, в последнее время большое внимание уделялось строению околоядрышкового хрома­ тина. При альдегидных фиксациях (формалин, глютаральдегид) вокруг ядрышка выявляется компактная зона околоядрышкового хроматина. Такой конденсированный хроматин виден не только по периферии ядрышка, но и между петлями нуклеолонемы. Имен­ но в эти зоны хроматина включается Н3-тимидин (Granboulan, Granboulan, 1964). При обработке фиксированных формалином

66 Интерфазное ядро

чения естественной ингибиции синтеза рРНК в клетках является кишечный эпителий мыши.

Как известно, в эпителии тонкой кишки мыши различаются две зоны: зона крипт, где происходит интенсивное размножение камбиальных клеток, и зона ворсинок, где клетки эпителия функ­ ционируют, не делятся, не синтезируют ДНК. Обновление всего эпителия тонкой кишки происходит за счет размножения клеток крипт, которые перемещаются к вершине ворсинок (Quastler, Hampton, 1962). К. Г. Газарян и А. С. Кульминская (1966) пока­ зали с помощью ауторадиографии, что в клетках кишечного эпите­ лия мыши синтез РНК происходит только в области крипт, тогда как клетки ворсинок практически не включают предшественники РНК (Н3-уридин). Синтез белка в этих двух отделах эпителия происходит, но уровень включения Н3-лизина в клетках ворсинок в два раза ниже, чем в клетках крипт. При электронномикроско­ пическом исследовании (Газарян и др., 1967) обнаружена пора­ зительная корреляция между структурой ядрышек и синтетической активностью этих клеток. Ядрышки в клетках крипт, где идет ин­ тенсивный синтез РНК, имеют типичное строение: их нуклеолонемная часть выражена хорошо, они богаты гранулами, фибрил­ лярные зоны невелики и не выделены в обособленные участки (табл. 14). Ядра в таких клетках гомогенны. Совершенно другую структуру имеют ядра клеток в ворсинке. Хроматин в них в виде глыбок располагается по периферии; часто сгущения хроматина лежат рядом с ядрышком, но резко отличаются от него структу­ рой и плотностью. Структура ядрышек в данном случае совершен­ но иная, чем в клетках крипт. Сильно осмиофильные ядрышки здесь не обладают нуклеонемной структурой. Они представляют собой плотные образования, состоящие сплошь из тесно располо­ женных тонких (40—80 А) фибрилл. Гранул в них нет совсем или же одиночные гранулы встречаются иногда по периферии.

Перечисленные выше типы ядер очень характерны для двух основных типов клеток кишечного эпителия: клеток ворсинок и клеток крипт. Между этими отделами существует небольшая пере­ ходная зона, занимающая всего около одного десятка клеток, ядра и ядрышки которой также имеют переходное строение. В этих клетках происходит постепенная утрата нуклеолонемного строения ядрышек, потеря или сильное уменьшение гранулярного компо­ нента, структуризация хроматина. Особенно сильно структуриро­ ван хроматин в клетках верхушки ворсинок. Ядрышки в этих клетках часто отсутствуют.

При окраске срезов метилгрюн-пиронином ядрышки всех зон эпителия кишечника приобретают отчетливый красный цвет. Эта окраска не снималась предварительной обработкой срезов теплой водой и полностью снималась, так же как и окраска цитоплазмы, после обработки срезов рибонуклеазой. Следовательно, можно

Р и о . 6. Функциональные изменения структуры ядрышек

2, 3 — и н в о л ю ц и я с т р у к т у р ы п р и н и зк о й ак ти в н о с т и ; з, 4, 1 — п ер ех о д к вы сокой а к ти в н о ст и

При дальнейшем развитии в гаструле в связи с началом синтеза рРНК у X. laevis в фибриллярных предъядрышках начинают появ­ ляться гранулы, и после этого в ядрах обнаруживаются ядрышки типичного строения (Нау, 1967, 1968; Jacob, 1969). У мутантных особей такого превращения фибриллярных предъядрышек в истин­ ные ядрышки не происходит.

Сходная картина изменения ядрышка наблюдается и на других объектах. Так, у морского ежа первичные ядрышки (проядрышки, предъядрышки) состоят только из фибрилл и не включают Н3-ури- дин; на ранней гаструле начинается включение метки, и к этому времени появляется гранулярный компонент (Karasaki, 1968). Скорее всего, такая динамика структурных изменений ядрышка при переходе в активное состояние присуща не только клеткам в онтогенезе. Так, в клетках эпителия радужины тритона, которые характеризуются низкой синтетической активностью, мелкие яд­ рышки представляют собой агрегаты тонкофибриллярных компо­ нентов с небольшим числом гранул. Когда же этот эпителий вовле­ кается в процессы регенерации, ядрышки постепенно приобретают гранулярное строение (Karasaki, 1964).

Суммируя эти наблюдения, мы видим, что ультраструктура яд­ рышек зависит от активности синтеза РНК: при высоком уровне

синтеза рРНК в ядрышке выявляется большое число гранул, при прекращении синтеза количество гранул падает, ядрышки превра­ щаются в плотные фибриллярные тельца базофильной природы (рис. 6). Каково функциональное значение этих остаточных фиб­ риллярных рибонуклеопротеидов, пока совершенно не ясно.

Патологические изменения ядрышка

Вопрос о функциональных изменениях структуры ядрышка мо­ жет быть решен, если использовать различные факторы, подавля­ ющие его специфическую активность.

Резкие, но обратимые структурные изменения обнаружены в ядрышках клеток культуры ткани при кратковременном повыше­ нии температуры до 40° (Simard, Bernhard, 1967): в ядрышках ис­ чезали гранулы, ядрышки представляли собой плотные фибрил­ лярные образования. При этом не нарушалась молекулярная структура РНК ядрышек (45S и 28S ядрышковая РНК), но пол­ ностью подавлялось включение Н3-уридина (Simard et al., 1969). Авторы считают, что исчезновение гранулярных форм РНП при повышении температуры объясняется тем, что ядрышковые гра­ нулярные формы РНП испытывают конфигурационный переход в фибриллярные формы.

О влиянии разных химических веществ, в том числе ингибито­ ров, на структуру ядрышек существует обширная литература (см.

обзоры Bernhard, 1966; Svoboda, Higginson, 1968).

Оказывается, большой ряд химически различных веществ и физических факторов вызывает более или менее сходную монотон­ ную структурную перестройку ядрышка. Главной общей чертой реакции ядрышка на различные повреждения является так назы­ ваемая сегрегация его компонентов (см. табл. 13, 14). Это явление морфологически выражается в резком сжатии ядрышек и обособ­ лении фибриллярной и гранулярной зон и в последующей редук­ ции гранул РНП. Свобода и Хиггинсон (Svoboda, Higginson, 1968) различают макро- и микросегрегацию. Макросегрегация характе­ ризуется присутствием больших плотных компактных зон, состо­ ящих из фибрилл оксифильной белковой природы или гранул РНП. Фибриллярные оксифильные зоны в этих случаях обычно располагаются на периферии ядрышек, образуя участки, называе­ мые «шапочками» (caps, cappings —у английских авторов), напо­ минающие «ушки Микки-Мауса» (Kasten, 1966). Размер этих «шапочек» может быть так велик, что они хорошо видны в свето­ вом микроскопе.

При микросегрегации мелкие обособленные и сжатые фибрил­ лярные зоны разбросаны внутри гранулярной части ядрышка. Часто после этих видов сегрегации наступает распад ядрышка на фрагменты.

Первые наблюдения за «шапочками» были проведены в связи с исследованиями действия канцерогенных веществ или антибиоти­ ков на клетки. Так, в серии работ Монтгомери (Montgomery, 1963; Paul et al., 1969) показано, что «шапочки» образуются после воз­ действия 4-нитрохинолин-]М-оксида. Вначале эти авторы считали такую реакцию ядрышек уникальной, связанной со специфичес­ ким подавлением этим канцерогеном активности дыхательной сис­ темы клетки с последующим падением синтеза белка и РНК.

Но оказалось, что подобные изменения ядрышек вызываются актиномицином Д, подавляющим синтез РНК (Schoefl, 1964). В первом подробном описании сегрегации ядрышек при действии актиномицина Шофль отмечала обособление трех зон: грануляр­ ной, фибриллярной и аморфной. Такого типа изменения возника­ ют как в культуре ткани, так и на целых животных (Stenram, Willen, 1966). Интересно, что подобную сегрегацию испытывают гигантские ядрышки слюнных желез двукрылых (Stevens, 1964).

Целый ряд канцерогенов (лазиокарпин, З-метил-4-диметилами- ноазобензол, диметилнитрозамин, танниновая кислота и др.) вы­ зывает у крыс сегрегацию ядрышек, что происходит одновремен­ но с подавлением включения Н 3-уридина в ядра и рРНК (Reddy,

ll. Структура и химия ядрышка И

Svoboda, 1968). Сходные структурные изменения вызывает этионин (Miyai, Steiner, 1967). Кроме актиномицина, сегрегацию яд­ рышек вызывают другие антиметаболиты, такие как профлавин,

акридиноранж (Reynolds, Montgomery, 1968), хинакрин (Fedorko, Hersch, 1969), митомицин C (Lapis, Bernhard, 1965), антрами-

цин, циклогексимид (Harris et al., 1968), гидроксимочевина (Geuskens, 1968).

Простое перечисление этих агентов снимает вопрос о специфи­ чности реакции ядрышка. Однако все эти агенты вызывают паде­ ние синтеза РНК в виде первичной (для актиномицина) или вто­ ричной (у митомицина, циклогексимида и др.) реакции клетки. Большая часть исследователей приходит к выводу, что сегрегация ядрышек отражает подавление зависимого от ДНК синтеза РНК

(Bernhard, 1966).

Различные формы ядрышковой сегрегации встречаются при вирусных (Bernhard, 1966; Jacob, 1968) и иных инфекциях (Jezequel et al., 1967).

Облучение ядрышек ультрафиолетом также вызывает появле­ ние «шапочек» (Montgomery et al., 1966).

Все виды сегрегации сопровождаются сжатием ядрышек и уменьшением объема гранулярного компонента.

Таким образом, мы видим, что самые разнообразные воздейст­ вия могут вызывать сходные изменения в структуре ядрышек; иными словами, ядрышки на многие воздействия отвечают моно­ тонной реакцией, различающейся в ряде случаев лишь степенью проявления (рис. 7.). Это — сжатие ядрышка, обособление фиб­ риллярных и гранулярных зон, потеря гранулярного компонента, распад всей структуры. Эти изменения могут отражать степень повреждения ядрыш ковых структур, связанных, главным обра­ зом, с искусственным подавлением синтеза ядрышковой РНК.

Тот факт, что различные формы ядрышек дают однообразную картину сегрегации, может быть использован для идентификации истинно ядрышковых структур в ядре. Так, например, неактив­ ные фибриллярные микроядрышки в клетках ворсинки кишечни­ ка мышей при действии актиномицина проявляют типичную сег­ регацию (см. табл. 14).