книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

половой хроматин), так и отдельных хромосомных участков, теломер (Онищенко и др., 1972) или центромер (Данжар, 1950).

Как нам кажется, общий вопрос о структуре хромосом в клет­ ке можно разделить на несколько связанных друг с другом отдель­ ных вопросов: структура элементарных хромосомных единиц — фибрилл ДНП, структура хроматина в интерфазных ядрах, струк­ тура хроматина при переходе клетки в митоз, структура митоти­ ческой хромосомы.

Другой важный компонент клеточного ядра — ядрышко. Яд­ рышко не самостоятельная структура, это специализированный участок на хромосомах, который выполняет функции, связанные с синтезом рибосомной РНК и синтезом рибосом. Поэтому его по­ ведение в значительной степени связано с общим поведением хро­ мосом в жизненном цикле клеток. Главными вопросами в изучении ультраструктуры ядрышек являются: вопрос о принципах их ор­ ганизации, об особенностях структуры ядрышек в зависимости от их функциональной нагрузки, об их жизненном цикле и поведении

имеющая специальные аппараты связи кариоплазмы и цитоплаз­ мы (поры), как известно в настоящее время, не только участвует в разграничении клетки на два основных по объему компонента, не только играет ведущую роль в распределении веществ между ядром и цитоплазмой, но и является важным фактором стабили­ зации внутриядерной структуры.

Эти три основные компонента ядра и рассматриваются в дан­ ной монографии, где авторы сделали попытку представить себе об­ щую картину строения и поведения этих ядерных компонентов на протяжении всего клеточного цикла.

Интерфазное ядро

I.СТРУКТУРА ХРОМОСОМ

Говоря о тонком строении хромосом, мы исходим из теории о не­ прерывности существования хромосомы как структурной единицы в жизненном цикле клетки. Химические и морфологические признаки позволяют нам рассматривать хромосому как некую единицу, динамически меняющуюся в зависимости от ее функ­ циональной нагрузки. Однако ввиду того обстоятельства, что в настоящее время вопрос о принципах строения хромосом не решен и число фактов, относящихся к этому вопросу, крайне мало, необходимо разделить общую проблему о структуре хромо­ сомы на ряд более мелких, но подчиненных этой проблеме во­ просов. Как нам представляется, поняв принципы общей органи­ зации хромосом, исследователи могут вплотную подойти к глав­ ному вопросу, связанному с изучением клеточного ядра: какова структура и морфология хромосомы во время ее функционирова­ ния, как хромосома осуществляет свою ведущую роль во всей жизнедеятельности клетки, т. е. как хромосома работает. К сожа­ лению, по ряду причин, изложенных выше, пока не найдены

Химическая организация хромосомных элементов

Как хорошо известно, в интерфазных ядрах при изучении их цитологическими методами выявляются структуры, содержащие ДНК, называемые хроматином. Эти хроматиновые структуры являются вариантом организации хромосом, характерным для

ядра в интерфазном состоянии. Хроматиновые структуры интер­ фазных ядер могут быть достаточно легко выделены для биохи­ мического или структурного анализа. Поэтому основные харак­ теристики о химической композиции хромосом были получены на выделенном хроматине, который представляет в основном дезоксирибонуклеопротеид, сложный комплекс ДНК и разных белков, большую часть которых составляют так называемые ги­ стоны.

ДНК хроматина и хромосом

Этому вопросу посвящена значительная литература (Мирский, Осава, 1963; Боннер, 1967; Браше, 1960; Буш, 1967; Георгиев, 1971), поэтому наша задача — дать краткую химическую харак­ теристику хроматина именно в связи со структурой хромосомы, со структурой ее элементов.

Основные методы получения растворов хроматина для хими­ ческого и морфологического анализов основаны на разрушении ядер и экстракции хроматинового материала растворами низкой ионной силы (Zubay, Doty, 1959; Bonner, 1965; Георгиев, 1971).

При этом участки хроматина набухают и превращаются в сильно набухший гель. Чтобы такие препараты перевести в раствор, необходимы сильные механические воздействия: встряхивание, перемешивание, гомогенизация. Эти процедуры приводят к раз­ рыву длинных нитчатых структурных единиц хроматина. Поэто­ му при исследовании таких препаратов необходимо учитывать эти обстоятельства, а также то, что получаемый препарат нахо­ дится в условиях растворов низкой ионной силы, резко отличных от того, что есть в живом ядре.

Основными химическими компонентами хроматина являются

мощью рентгеноструктурного анализа к этому заключению при­ шли Уилкинс и Зюби (Wilkins et al., 1959). В работе О. Ф. Бо­ рисовой и Э. Е. Минят (1969) был сделан вывод о том, что струк­ тура участков ДНП, доступных для адсорбции с акридиновым оранжевым, соответствует структуре нативной, двухспиральной ДНК. О двунитчатом спиральном состоянии ДНК в хроматине говорят также опыты по тепловой денатурации. При нагревании растворов нуклеогистонов наблюдается гиперхромный эффект, связанный с разрывом межнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК, аналогично тому, что происходит при плав­ лении чистой ДНК. Однако температура плавления ДНК в со­ ставе хроматина выше, чем у свободной ДНК, и диапазон пере­

1964). Эти данные показывают, что ДНК в комплексе с белками хроматина обладает большей стабильностью по отношению к де­ натурирующему воздействию температуры.

Вопрос о величине молекул ДНК в составе хроматина и хро­ мосом имеет важное значение для понимания структуры хромо­ сомы в целом. ДНК, выделенная из хроматина, обладает молеку­ лярным весом 7—9 млн., что значительно меньше молекулярного веса ДНК из Е. coli (2,8 -109) (Cairns, 1963). По мнению Боннера

(Bonner, 1965), такой сравнительно малый молекулярный вес ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. И дейст­ вительно, если выделять ДНК в условиях, исключающих встря­ хивание, гомогенизацию и т. д., то удается получить из ядер клеток высших животных молекулы ДНК очень большой длины. Эта возможность появилась после применения метода Кернса

в том, что клетки с меченной тритированным тимидином ДНК мягко лизировались, лизат помещали на миллипоровый фильтр, в котором ДНК застревала, после чего такие фильтры обрабаты­ вали радиографически. Так, Кернс (Cairns, 1966) показал, что радиоавтографы отдельных меченых молекул ДНК из клеток HeLa могут достигать длины 500 мк. Хюберман и Риггс (Huberman, Riggs, 1966) обнаружили в клетках китайского хомячка молекулы длиной до 180 мк. Сасаки и Норман (Sasaki, Norman, 1966) обнаружили фибриллы ДНК длиной более 2 см в ядрах лейкоцитов человека. Во всех случаях эти молекулы ДНК имели линейный характер в отличие от кольцевидных молекул ДНК фагов и бактерий.

Эти факты хорошо согласуются с расчетной величиной коли­ чества ДНК и ее длины, приходящейся на хромосому. Так, Бон­ нер (Bonner, 1965) считает, что хромосома гороха имеет длину, соответствующую молекулярному весу 250-10"; это показывает, что в ней содержится ДНК несколько больше, чем в 100 хромо­ сомах Е. coli. По расчетам Дю Про (Du Praw, 1968, 1970), в хро­ мосомах человека должны заключаться молекулы ДНК длиной

от 1,5 до 7 см.

Пространственная организация таких гигантских молекул в хромосомах остается неясной. Представлена ли хромосома одной такой гигантской молекулой или же она состоит из ряда более коротких молекул ДНК, располагающихся параллельно друг другу,— эти вопросы имеют большое значение для понимания структуры хромосомы в целом.

Совсем недавно появились исследования, показывающие, что в составе отдельных хромосом может быть обнаружена одна мо­

показано, что расчетный молекулярный вес молекулы ДНК на одну хромосому дрожжей Saccharomyces cerevisiae должен со­ ставлять в среднем 6 • 108 дальтон. Прямые исследования моле­ кулярного веса таких ДНК дали величины от 1-108 до 12-108 дальтон, а при изучении этих ДНК в электронном микроскопе они достигали длины от 50 до 355 мк. Это позволило авторам за­ ключить, что большинство, и очень возможно, все хромосомы дрожжей содержат одну молекулу ДНК. Сходные значения мо­ лекулярного веса хромосом ДНК у этого же организма были получены и в другой работе (Marmur et al., 1973). Более того, были выделены молекулы ДНК огромного молекулярного веса (больше 3 • 108 дальтон) из хромосом клеток культуры дрозофилы (Hearst, 1973). Как бы ни была устроена митотическая хромосо­ ма, в ее организации должен использоваться принцип макси­ мально плотной упаковки элементов. Действительно, для того, чтобы молекулу ДНК длиной до нескольких сантиметров уло­ жить в структуру митотической хромосомы толщиной около 0,5 мк и длиной в несколько микрон, необходимо такую молекулу или изгибать, чтобы она укладывалась продольными рядами, или заставить ее скручиваться, используя спиральный тип ком­ пактной упаковки. Вероятно, ДНК в комплексе с белком-гистоном может несколько менять свою жесткую структуру, что обеспечи­ вает способность таких нуклеопротеидных комплексов к сверх­ скручиванию (Zubay, 1964).

Опыты с кратковременным мечением хромосом тритированным тимидином показали, что такая метка в митотических хро­ мосомах распределяется с определенной закономерностью. Как правило, синтез ДНК происходит в первую очередь в эухроматических районах хромосом и в последнюю — в гетерохроматиче­ ских. Но самое главное, что метка по длине хромосом появляется

основой для предположения Тейлора о существовании в хромо­ сомах отдельных звеньев из молекул ДНК, соединенных белко­ выми связками. Представления Тейлора ненадолго предвосхитили наблюдения Кернса над молекулами ДНК из хромосом высших

организмов.

Кернс (Cairns, 1963) показал, что кольцевая молекула ДНК из кишечной палочки представляет собой единицу репликации, или репликон. Такая кольцевая молекула имеет только одну начальную точку репликации и реплицируется по полуконсервативному способу. Если изучать такие молекулы в процессе реп­ ликации, то на радиоавтографах в местах удвоения нитей ДНК видно их расхождение в виде вилки,

из многих отдельно реплицирующихся отрезков, соединенных последовательно.

Эти наблюдения подтвердили и развили в подробном исследо­ вании Хюберман и Риггс (Huberman, Riggs, 1968). Краткие итоги их наблюдений следующие. Длинные фибриллы хромосом­ ной ДНК построены из многих последовательно друг с другом соединенных участков репликации. ДНК реплицируется в вилко­ образных точках роста. Обычно ДНК синтезируется в противо­ положных направлениях в смежных зонах репликации. Каждый репликон ограничен точкой начала репликации и термальной точкой, поэтому в каждом репликоне удвоение ДНК будет идти от точки начала репликации к терминальной точке. Средняя величина репликона — 30 мк, хотя встречаются репликоны очень короткие (несколько микрон) и очень длинные — до 160 мк. Соседние репликоны могут реплицироваться в разное время. Скорость репликации составляет около 2,5 мк в 1 мин.

По данным Кернса о репликации ДНК у Е. coli нельзя было выяснить, идет ли рост дочерней молекулы ДНК в одном направ­ лении или в двух противоположных, как это показано для ДНК животных (Huberman, Riggs, 1968). Но в недавней работе (Wake, 1972) была обнаружена двунаправленная репликация ДНК у

Bacillus subtilis.

В серии работ Тейлора (Taylor, Miner, 1968; Taylor et al., 1968; Schandl, Taylor, 1969) показано, что внутри репликонов синтез ДНК идет путем начального синтеза коротких отрезков ДНК (около 1000 нуклеотидов), которые быстро сшиваются в более длинные цепи длиной до 10—40 мк; эти последние в свою очередь сшиваются, давая гигантские цепи хромосомных ДНК. Таким образом, вероятно, механизм репликации в принципе оди­ наков у ядерных и безъядерных организмов, но эукариоты отли­ чаются тандемным линейным расположением репликонов в ги­ гантской незамкнутой молекуле ДНК.

Существуют единичные данные о циклических ДНК у высших организмов. Так, Хотта и Бассель (Hotta, Bassel, 1965), исследуя ДНК, получепную из спермы быка и проростков пшеницы, с помощью электронного микроскопа наблюдали циклические ДНК, сильно гетерогенные по своей величине. Значение этих наблю­ дений кажется сомнительным, так как циклические формы ДНК в препаратах могут быть или продуктом загрязнения ядерной ДНК митохондриальной ДНК, или результатом ренатурации мо­ лекул ДНК в местах разрывов с одинаковыми повторяющимися последовательностями (Thomas et al., 1970; Stevens, Moustacchi, 1971),

18 Интерфазное ядро

экстрагируются более высокими концентрациями солей. Это позволило подойти вплотную к изучению вопроса о функцио­ нальной роли этих белков.

В многочисленных работах лаборатории Боннера (Bonner, 1965; Bonner et al., 1968) показано, что матричная активность ДНК в составе хроматина зависит от количества связанного с ней

данные о матричной активности хроматина из разных объектов: степень этой активности была прямо пропорциональна количеству ДНК, не связанной с гистоном. Отсюда делался прямой вывод о том, что гистоны являются репрессорами матричной активности ДНК в составе хроматина.

Как оказалось (Bonner et al., 1968; MacGillivray, 1968), ги­ стоны из клеток разных тканей, а также гистоны клеток разных организмов очень схожи. Поэтому было неясно, как такая чис­ ленно ограниченная группа белков может осуществлять регуля­ цию репрессии и дерепрессии разных генов, обладающих самой разнообразной нуклеотидной последовательностью.

Боннер и его сотрудники (Bonner et al., 1968; Shin, Bonner, 1969; Holmes et al., 1972) обнаружили, что при экстракции и раз­ делении гистонов и ДНК в градиенте плотности CsCl в зоне ги­ стонов содержится малое количество (0,01—0,05% от массы ДНК) РНК, отличной от других известных типов РНК. Эта хро­ мосомная РНК, видимо, связана с белком, так как устойчива к действию РНК-азы. Хромосомная РНК отделяется от ДНК хро­ матина нагреванием растворов, что может свидетельствовать о ее комплементарной связи с ДНК. Хромосомная РНК состоит из ко­ ротких цепей, содержащих около 40—60 нуклеотидов. По своему составу она гетерогенна (связывает около 5% денатурированной ДНК). Авторы считают, что эта хромосомная РНК ковалентно связана с белком, который с помощью водородных связей комплексируется с гистонами. Специфичность репрессирующего дейст­ вия гистонов, следовательно, определяется специфичностью от­ дельных молекул хромосомных РНК, которые могут комплемен­ тарно связываться с определенными местами на ДНК; к такому комплексу затем присоединяется гистон. В пользу этих представ­ лений говорят следующие эксперименты. Нуклеогистон подвер­ гается воздействию 2 М NaCl, чтобы вызвать полную диссоциацию ДНК и гистонов. Если затем проводить реконструкцию нуклеогистона путем понижения концентрации солей в среде диализом против воды, то гистоны связываются вновь с ДНК, но беспоря­ дочно. Это доказывается тем, что РНК, синтезированная на таком нуклеогистоне in vitro, не вступает в конкурентные взаимоотно­ шения с РНК, синтезированной на нативном хроматине при гиб­ ридизации ее с денатурированной ДНК, т. е. нуклеотидные по­

следовательности этих РНК разные. Следовательно, посадка ги­ стонов на ДНК в случае такой реконструкции была неспецифи­ ческой. Однако удалось получить специфическую реконструкцию в присутствии мочевины, которая как объясняют авторы, облег­ чает начальную гибридизацию РНК с ДНК. При удалении хро­ мосомной РНК такой специфической реконструкции хроматина не происходит.

Дж. Полу и Гилмуру (Paul, Gilmour, 1968, Paul et al., 1970)

удалось получить специфическую реконструкцию хроматина толь­ ко в присутствии на ДНК белковых остатков, негистонового ти­ па, после удаления только одних гистонов. Специфическая рекон­ струкция нуклеогистона не происходит, так же как и у Боннера, если брать полностью депротепнизированпую ДНК и гистоны. Пол и Гилмур считают, что гистоны действительно могут закры­ вать ДНК в хроматине и предотвращать ее работу в качестве ма­ трицы для синтеза РНК, но этот эффект неспецифичен; другие, не­ гистоновые, белки ответственны за обнажение специфических по­ следовательностей на ДНК (Paul et al., 1970).

Совсем иные представления о функциональной роли гистонов высказываются >в работах из лаборатории Мирского (Allfrey et al., 1966; Allfrey, 1970). Необходимой предпосылкой для синтеза но­ вых РНК на ранее репрессированных генных локусах является, по их мнению, изменение структуры хроматина, вызванное аце­ тилированием гистонов или происходящее одновременно с этим процессом. Другой признак активного хроматина — фосфорили­ рование серина в ядерных белках, в том числе в гистонах. Фосфо­ рилирование связанных с хромосомами белков влияет на взаимо­ действие ДНК с гистонами и приводит к сдвигу от компактного состояния (неактивного) к диффузному (активному); дефосфори­ лирование может снова привести к плотному скручиванию ком­ плекса ДНК — гистон. Олфри и др. (Allfrey et al., 1966) разделя­ ют точку зрения о том, что часть ядерной РНК может играть роль регуляторов или «распознавателей».

Гистоны, связываясь с ДНК, вызывают агрегацию хроматина в условиях растворов с ионной силой, близкой к физиологиче­ ским растворам (0,05—0,2 М NaCl). Это свойство гистонов может отражать их другую функцию, структурную. Удаление части гис­ тонов с помощью 0,6 М NaCl приводит к растворению осадка хро­ матина (Lucy, Butter, 1955). Обработка хромосом трипсином при­ водит к их набуханию и диспергированию (Буш, 1967; Cole, 1967; Cole, Lungley, 1966), так же как и помещение их в солевые растворы. Эти наблюдения указывают в первую очередь на роль гистонов как факторов, поддерживающих или определяющих структуру хромосом и хроматина. Очевидно, что гистоны, вза­ имодействуя с ДНК, функционируют не только как репрессоры, но и как факторы структуризации хроматина (Johns, 1972). По пред­

20 Йнтерфазное ядро

ставлениям Зюби (Zubay, 1964), гистоны могут образовывать мос­ тики между молекулами ДНК, что может приводить к сверхскру­ чиванию ДНК в составе хроматина и хромосом.

Вероятнее всего, что эти две функции гистонов (репрессия матричной активности и структуризация ДНП) тесно связаны между собой. В пользу этого говорят опыты Георгиева и сотр. (1967), в которых показано, что удаление фракции гистонов, бо­ гатых лизином (Fj), приводит, с одной стороны, к резкому увели­ чению матричной активности, а с другой стороны, к изменению структуры хроматиновых фибрилл, к их утоныпению до 40 А. В неактивном (или слабоактивном) состоянии фибриллы хромати­ на имеют толщину 100—200 А. Вероятнее всего, что изменение толщины фибрилл связано не просто с потерей белка (при экстрак­ ции гистонов 0,6 М NaCl удаляется около 20—25% суммарного белка ДИП), а с перестройкой самой структуры молекул дезоксирибонуклеопротеида.

Георгиев и сотр. (1970) показали, что обработка препаратов ДНП 4 М растворами мочевины приводит к растворению ДНП без потери его белковых компонентов, при этом нити ДНП утонь­ шаются до 40 А. Авторы объясняют это тем, что мочевина нару­ шает слабые взаимодействия типа водородных связей и, возмож­ но, гидрофобные взаимодействия, ответственные за образование сшивок между разными участками молекулы ДНП или между

также говорят о сверхспирализации ДНК в составе ДНП, в ре­ зультате чего возникает вторичная спираль с шагом 120 А и диа­

метром 100 А.

Гистоны играют большую роль в структуризации хроматина не только на уровне макромолекул. Известно, что ядра многих клеток обладают двумя формами хроматина: компактным — плот­ ным и диффузным — рыхлым. В ядрах лимфоцитов образование компактных масс хроматина связано с высоким содержанием в них лизинового гистона. Ауторадиографически было найдено, что зоны плотного хроматина неактивны в отношении синтеза РНК, в то время как диффузные зоны хроматина включают меченые предшественники РНК (Unuma et al., 1968). Эти две формы хро­ матина удалось выделить препаративно (Frenster et al., 1963). Структуризирующая роль гистонов, богатых лизином, показана на выделенных ядрах и хромосомах (Mirsky et al., 1968). Если экстрагировать гистоны, богатые лизином, из выделенных хромо­ сом, то последние разрыхляются и под электронным микроско­ пом имеют вид сетчато-фибриллярных структур. Добавление к таким экстрагированным хромосомам гистонов, богатых лизином, приводит к восстановлению исходной плотности структуры хро­ мосом. Интересно, что добавление к хромосомам, лишенным ли-