книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

неясны механизмы, поддерживающие эту систему. Перифериче­ ское расположение конденсированных Х-хромосом у млекопитаю­ щих, теломерных хромоцентров у A. fistulosum или центромер (Данжар, 1950; Fussell, 1972) наводит на мысль, что необходи­ мым звеном в создании стабильной ориентации хромосом в интер­ фазном ядре может быть их специфическая ассоциация с ядерной оболочкой. Большая часть сведений, подтверждающих это пред­ положение, получена при изучении клеток, когда морфологически выраженные хромосомы окружены ядерной оболочкой, как, напри­ мер, в профазе мейоза или в гигантских ядрах слюнных желез не­ которых двукрылых насекомых.

Так, Мозес (Moses, 1956) и Фосет (Fawcett, 1956) описали кон­ тактирование концов мейотических хромосом с ядерной оболочкой. Позднее Моэнс (Moens, 1969) на основе пространственной рекон­ струкции ядер сперматоцитов Locusta показал, что оба конца мейо­ тических хромосом крепятся на ядерной оболочке в ограниченной зоне ядра. При этом в зоне контакта образуются специальные структуры типа «базальных выпуклостей» (Wollam et al., 1967).

Изучение ядер клеток слюнных желез Chironomus в стереоско­ пическом микроскопе показало, что теломерные районы хромосом (кроме одного плеча IV хромосомы) обязательно располагаются на периферии ядра около оболочки (Груздев, Кикнадзе, 1970). Элек­ тронномикроскопическое исследование таких хромосом (Перов, Ченцов, 1971) обнаружило, что в теломерных участках происходит разрыхление продольных нитей хромосом: они образуют кистепо­ добное расширение, которое оканчивается прямо на ядерной обо­ лочке. При этом видно, что нити хроматина тесно контактируют с

ядерной оболочкой (табл. 7).

Другим примером обязательного околомембранного расположе­ ния хромосом является тельце Барра, Х-хромосома (Miles, 1964). В тесном контакте с ядерной оболочкой находятся также теломер­ ные хромоцентры у Allium fistulosum (см. табл. 7). По поводу действительного контакта центромерных участков хромосом с ядер-, ной оболочкой пока сведений не имеется, но исключить эту возмож­ ность нельзя.

Поэтому вполне оправдан поиск каких-либо ультраструктурных особенностей в местах постоянного связывания хромосом с ядерной оболочкой интерфазного ядра. Однако пристальное изу­ чение зоны контакта Х-хромосомы с ядерной оболочкой в клет­ ках печени кошки (Коломиец и др., 1973) не выявило никаких Особых структурных отличий от контактов с ней любых участков хроматина. Не было найдено никаких специфических структур в местах контактов теломерных хромоцентров с ядерной оболоч­ кой и в клетках A. fistulosum (Онищенко, Ченцов, 1973) (табл. 5, 7). Не обнаружено никаких специальных структур и в теломерных участках политенных хромосом мотыля.

Все эти специализированные контакты хромосом интерфазного ядра с ядерной оболочкой не отличались от обычной формы связи с ней неспецифических участков хроматина.

Структурная и функциональная связь хроматина с ядерной оболочкой

Подробно структура и функция ядерной оболочки будут описаны ниже (см. раздел IV). Здесь мы только напомним, что ядерная оболочка состоит из двух липопротеидных мембран, разделенных перинуклеарным пространством. Внешняя ядерная мембрана гра­ ничит с собственно цитоплазмой клетки, внутренняя — с содержи­ мым ядра. Во многих местах на ядерной оболочке образуются стан­ дартной величины окончатые перфорации, заполненные сложной белковой структурой — комплексом ядерной поры.

То, что хроматиновый материал ядра часто тесно прилежит к ядерной оболочке, отмечено еще в классических цитологических описаниях (Белар, 1934, Вильсон, 1936; Данжар, 1950). При элек­ тронномикроскопических исследованиях также подчеркивается непосредственный контакт части хроматинового материала интер­ фазного ядра с внутренней мембраной ядерной оболочки (Gay, 1956; Davies, Small, 1968; Du Praw, 1968; Camings, Okada, 1970). To, что такое контактирование не является просто отображением пассивной пространственной связи между хроматином и ядерной оболочкой, показано в опытах с центрифугированием ядер. Так, Бреннер (Brenner, 1953) показал на уровне световой микроскопии, что после длительного центрифугирования часть хроматина остает­ ся на периферии в центрипетальной части ядра. Более подробно это явление было проанализировано с помощью электронного ми­ кроскопа (Beams, Mueller, 1970), и показано, что связь хроматина с внутренней ядерной мембраной не нарушается даже при ускоре­ нии до 150 тыс. g. В ядре при этом видны хроматиновые фибрил-

. лы, тянущиеся вдоль оси центрифугирования, причем скорее про­ исходит разрыв фибрилл, чем отделение их от оболочки. При этом большая часть хроматина и ядрышек осаждается в центрифугальной зоне, но всегда в центрипетальной части ядра на ядерной обо­ лочке остается узкий ободок связанного с ней хроматина. Анало­ гичные результаты получили Онищенко и Ченцов (1972). Так, при центрифугировании кусочков печени мыши и лягушки в изо­ тонических растворах в ядрах оседает основная масса конденсиро­ ванного хроматина и ядрышек, но в центрипетальной части ядра пристеночный периферический хроматин сохраняет связь с оболоч­ кой ядра даже при нагрузках до 130—220 тыс. g (табл. 8). Эта связь не нарушается и в гипотонических условиях, когда происхо­ дит полная деконденсация всего хроматина. Сходные данные полу­ чены при таком центрифугировании корешков Allium fistulosum.

В этом случае даже плотные теломерные хромоцентры, связанные с ядерной оболочкой, сохраняют свое пристеночное положение в центрипетальной части ядра. При этом под действием силы тяже­ сти часто происходит втягивание части ядерной оболочки, контак­ тирующей с хромоцентром, внутрь ядра. Сходные картины наблю­ даются и в профазных ядрах.

Эти наблюдения дают основание считать, что морфологическая картина контакта периферического хроматина с ядерной оболочкой отражает существование настоящей структурной связи между эти­ ми ядерными компонентами. Более подробный анализ свойств са­ мой периферической части пристеночного хроматина позволяет приблизиться к пониманию природы этой структурной связи.

В серии работ Дэвиса и сотр. (Davies, 1968; Davies, Small, 1968; Everid et al., 1970) изучалась структура пристеночного кон­ денсированного хроматина на многих клетках животных. Во всех случаях обнаружена регулярная упаковка самого периферическо­ го слоя хроматина, граничащего с внутренней ядерной мембраной. Авторы наблюдали слой, состоящий из электронноплотных лент и гранул, отделенный от внутренней ядерной мембраны и остально­ го хроматина слоями меньшей электронной плотности. Толщина такого трехслойного комплекса довольно стандартна для разных клеток и равна 300—500 А. Предполагается, что электронноплот­ ные ленты представляют собой цилиндрическую нить, которая на срезах может выглядеть в виде коротких отрезков, параллельных линий, гранул. Авторы склонны думать, что описываемая струк­ тура в конечном итоге имеет форму короткой палочки, и называют ее структурной единицей гетерохроматина.

Этот слой периферического гетерохроматина особенно хорошо выявляется в ядрах в гипотонических условиях (Brinkley, 1967). Бартон и др. (Barton et al., 1971) показали, что если выделенные ядра обрабатывать 0,5%-ным раствором детергента «Тритон X- 100», то ядерная оболочка полностью исчезает, что подтверждает­ ся перманганатной фиксацией! таких обработанных ядер. При этом на периферии ядра четко выявляется слой гранул перифериче­ ского хроматина. Интересно, что свежие нефиксированные ядра после обработки этим детергентом, несмотря на полное отсутствие ядерной оболочки, не теряют своей целостности и формы, что, повидимому, обеспечивается наличием этого хроматинового слоя. Та­ кой гранулярный слой выявляется во всех участках, где хроматин контактирует с ядерной оболочкой (табл. 9). Он обнаруживает­ ся в зоне контакта Х-хромосомы с ядерной оболочкой в клетках печени кошки, в зоне теломерных хромоцентров в клетках Allium fistulosum (Онищенко, Ченцов, 1972). В клетках на стадии профа­ зы он выявляется только в местах контакта участков хромосом с ядерной оболочкой; места, свободные на этой стадии от хроматина, не имеют такого гранулярного слоя. В ядрах слюнных желез уча­

44 Интерфазное ядро

стки ядерной оболочки, не имеющие связи с хромосомами, также свободны от гранул. В ооцитах тритона на поздних стадиях разви­ тия, когда мейотические хромосомы собраны в центральной зоне, на ядерной оболочке нет такого гранулярного слоя.

По нашим наблюдениям, этот слой состоит из одного ряда гра­ нул величиной около 250—280 А, обладающих плотностью значи­ тельно большей, чем фибриллы хроматина. Эти гранулы погруже­ ны в слой аморфного вещества более низкой плотности. На танген­ циальных срезах видно, что эти плотные гранулы располагаются примерно на одинаковом расстоянии (около 250 А) одна от другой, и иногда виден гексагональный характер их укладки.

Зоны ядерных пор свободны от этого слоя. В ядрах с сильно разрыхленным хроматином в гипотонических растворах виден не­ посредственный переход хроматиновых фибрилл в эти гранулы, при этом создается впечатление, что к каждой грануле подходит одна фибрилла.

Химические свойства этого слоя изучены пока недостаточно. Так, Бартон и др. (Barton et al., 1971) показали его устойчивость к высоким концентрациям хлористого кальция. По нашим наблю­ дениям (Онищенко, Ченцов, 1972), в печени крыс после окраски по Бернхарду, выявляющей РНК-содержащие структуры, непо­ средственно под внутренней ядерной мембраной окрашивается слой толщиной около 100—150 А, однако дискретных гранул при этом не выявляется. При обработке выделенных в гипотонических сре­ дах ядер печени крыс разными агентами было показано, что грану­ лярный слой устойчив к обработке «Тритоном Х-100, РНК-азой, гиалуронидазой, фосфолипазой, дитиотриэтолом. Сахароза в кон­ центрациях 0,34 М также не вызывала никаких изменений в слое.

При действии ЭДТА, вызывающем уменьшение толщины фиб­ рилл ДНП от 200 до 100 А, этот слой сохраняется, но теряет чет­ кую структуру и становится тоньше. Обработка ядер растворами высокой ионной силы (0,4—0,6 М по NaCl) и проназой приводит к полному исчезновению этого слоя периферического хроматина.

После обработки выделенных ядер по Бартону «Тритоном Х-100» ядра сохраняют свою целостность до тех пор, пока остается интактным слой периферического хроматина. Повышение концент­ рации NaCl до 0,4—0,6 М приводит к быстрому растворению таких ядер, хотя в контроле без «Тритона Х-100» при этих концентраци­ ях солей ядра не исчезают. Быстрая дезинтеграция лишенных ядерной оболочки, но содержащих гранулярный слой ядер про­ исходит при действии на них проназы.

Как видно, поведение периферического гранулярного слоя при воздействии на него различных агентов сходно с поведением фиб­ рилл хроматина. Это проявляется в чувствительности к ЭДТА, в разрушении в гипертонических растворах. Правда, при концентра­ ции NaCl 0,4—0,6 М нуклеогистон лишь частично диссоциирует и

переходит в тонкие нити толщиной 60—100 А, а не полностью ра­ створяется. Все же нам кажется, что этот слой может представлять собой ДНИ, но, возможно, в ассоциации с иными белками, чем в ос­ новной массе хроматина.

На рис. 4 представлена грубая модель организации этого гра­ нулярного слоя периферического хроматина и его взаимосвязь с

другими элементами ядра.

Какова функциональная роль этого слоя, пока недостаточно ясно. Ясно лишь, что он может играть чисто структурную роль внешнего каркаса, который обеспечивает морфологическую цело­ стность ядра. Во всяком случае, он является структурой, опосреду­ ющей связь хроматина с ядерной оболочкой.

Другая возможность — участие этого слоя в процессах функцио­ нирования хроматина в интерфазном ядре. Основанием для тако­ го предположения послужили представления Жакоба и др. (Jacob et al., 1963) о связи хромосомы бактерий с плазматической мем­ браной. Эти авторы считают, что связь бактериальной ДНК с мем­ браной необходима не только для обеспечения пространственного разделения дочерних нуклеоидов после их репликации. Они вы­ двинули очень интересное предположение о том, что процессы реп­ ликации бактериальной ДНК происходят в области связи ДНК с мембраной и что именно в этой точке происходит инициация син-

Ф ДН П — ф и б р и л л ы Д Н П . Я д ер н ы е п опы д а н ы у п рощ ен н о

теза ДНК. В последнее время это представление Жакоба и др. (Jacob et al., 1963) было подтверждено многочисленными биохими­ ческими данными (Rosenberg, Cavaliery, 1968; Sueoka, Quinn, 1968).

Важно отметить, что в своей работе Жакоб и соавторы выска­ зали предположение, что такая же в принципе система фиксации репликонов служит основой для структуры хромосом высших ор­ ганизмов. Эта идея могла быть проверена экспериментально. Ко­ мингс и Какефуда (Comings, Kakefuda, 1968) на синхронизиро­ ванной избытком тимидина культуре клеток амниона человека с помощью электронномикроскопической ауторадиографии показа­ ли различие в локализации метки в ядре в зависимости от стадии синтеза ДНК. В самом начале периода синтеза метка располага­ лась по зоне ядерной оболочки и по периферии ядрышка. Затем метка появлялась и в более центральных участках ядра. Этим было показано, что у высших организмов инициация репликации ДНК может быть связана с ядерной мембраной. К сожалению, на других объектах эти наблюдения не подтвердились. Так, по данным Блондель (Blondel, 1968), при синхронизации клеток культуры КВ так­ же более активной по включению была периферия ядра, но в те­ чение всего S-периода, даже после смены радиоактивной среды на нерадиоактивную.

При репликации ДНК в ядрах лимфоцитов, стимулированных к делению фитогемагглютинином (Tokuyasu et al., 1968; Milner, Hayhoe, 1968; Milner, 1969), в самом начале синтеза метка Н3-ти-

мидина располагается не по периферии ядра, а на границе толсто­ го слоя конденсированного хроматина, который в это время начи­ нает переходить в диффузную форму. После полного перехода хроматина в диффузное состояние метка располагается преимуще­ ственно около ядерной оболочки. В другой работе (Erlandson, Нагven, 1971) при синхронизации клеток HeLa в начале S-периода метка распределена по ядру беспорядочно, она начинает локализо­ ваться на периферии лишь в конце периода синтеза ДНК. Эти неоднозначные цитологические наблюдения не позволяют сделать определенных выводов относительно функциональной значимости связи хроматина с ядерной оболочкой. Однако есть ряд биохимиче­ ских исследований, показывающих, что после разрушения мечен­ ных предшественниками ДНК ядер удается выделить фракцию, обогащенную новообразованной ДНК. Оказалось, что эта фракция представляет собой ДНК-мембранный комплекс (Fumio et al., 1971).

Представления, сходные со взглядами Жакоба и др. (Jacob et al., 1963), Комингса и Какефуды (Comings, Kakefuda, 1968), вы­ сказываются в теоретических построениях А. Н. Мосолова (1969). Они основаны на идее филогенетической преемственности в орга­ низации наследственного материала прокариотов и эукариотов.

Согласно этим представлениям, у эукариотических организмов в интерфазе ДНК хромосом фиксирована на ядерной мембране в точках начала репликации.

Сейчас еще рано делать окончательные выводы о природе и значимости связи хроматина с ядерной оболочкой. Возможно, что эта связь определяет не только инициацию, но и весь процесс репликации ДНК; вполне вероятно, что такая функциональная связь обязательна не для всей массы ДНК, а для определенных районов хромосомы.

Видимо, тесная структурная связь хроматина с периферией ядра может быть не обязательно связана с синтезом ДНК. Так, было показано, что как реплицирующийся, так и нереплицирующийся хроматин в клетках яйцевых оболочек личинок мучного клеща имеет сходную локализацию и структуру (Pawlowski, Вегlowitz, 1969).

Ультраструктура хроматина на различных стадиях митотического цикла

В этом разделе рассматриваются немногочисленные данные об ультраструктурных изменениях хроматина в пнтерфазных яд­ рах в течение предсиптетического (Gi), синтетического (S) и по­ стсинтетического (G2) периодов клеточного цикла. Вопрос об из­ менениях, связанных с образованием митотических хромосом, бу­ дет рассмотрен особо (см. стр. 107).

Если рассматривать структуру интерфазных ядер на ультратонких срезах в электронный микроскоп, то, как и в световом микроскопе, бросается в глаза то, что хроматин в ядре может су­ ществовать в двух формах: диффузной и конденсированной. Об­ щность этих форм заключается в том, что в обоих случаях основ­ ной структурной единицей являются элементарные фибриллы хроматина толщиной около 200—250° А. Различием же является степень плотности упаковки этих фибрилл. Плотные сгустки или тяжи конденсированного хроматина в литературе обычно опреде­ ляются как участки гетерохроматина. А. А. Прокофьева-Бельгов- ская (1971) обращает внимание на необходимость различать вы­ сокоспецифические гетерохроматические районы хромосом, отли­ чающиеся от эухроматических рядом физиологических и функ­ циональных особенностей, и гетерохроматизированные районы, каковыми могут быть участки как эухроматических, так и гетеро­ хроматических райопов. Гетерохроматизированные участкп (или гетеропикнотизированные) характеризуются тем, что в пнтерфазном ядре они представляют собой компактные конденсированные тела с инактивированными генами. Частота встречаемости и лока­ лизация таких участков конденсированного, гетеропикнотического, хроматина могут быть различны в ядрах разных объектов

48 Интерфазное ядро

(табл. 10). Так, например, в ядрах лейкоцитов почти весь хрома­ тин находится в конденсированном состоянии и располагается в виде толстого слоя плотно упакованных фибрилл на периферии ядра. Такое состояние хроматина коррелирует с низким метабо­ лическим уровнем активности такого типа ядер. В клетках с вы­ соким уровнем активности в отношении синтеза РНК и ДНК доля конденсированного хроматина, наоборот, мала. В таких ядрах (бластные клетки, эмбриональные клетки) большая часть объема занята диффузно расположенными фибриллами ДНП. Встречающиеся в этих случаях отдельные глыбки гетеропикнотического хроматина располагаются в толще ядра (хромоцентры) или чаще около ядрышка и вблизи ядерной оболочки.

Сложная и довольно пестрая картина в распределении хрома­ тина отмечена в ядрах клеток растений (см., например, классифи­ кацию Данжара 1950). Здесь чаще встречаются крупные зоны гетеропикнотизированного (конденсированного) хроматина. В ря­ де объектов такой конденсированный хроматин образует множе­ ство хромоцентров, нередко расположенных на ядерной оболочке (Allium fistulosum). В других случаях большая часть объема за­ нята конденсированным хроматином в виде довольно толстых (0,1 — 0,3 мк) нитчатых участков — хромонем (см. ниже).

Такие формы распределения хроматина в ядрах существенно меняются при смене фаз ядерного цикла. Как уже указывалось, в лимфоцитах при стимуляции синтеза ДНК происходит посте­ пенное разрыхление и переход в диффузное состояние перифе­ рического хроматина (Milner, 1969). По данным Токуиасу и др. (Tokuyasu et al., 1968), в «покоящихся» лимфоцитах большая часть хроматина представлена в виде конденсированного хрома­ тина, образующего подобие сети из крупных и мелких агрегатов. В начале синтеза ДНК начинают исчезать мелкие агрегаты, пере­ ходя в диффузную форму хроматина, затем практически весь конденсированный хроматин переходит в диффузное состояние. При переходе клеток в позднюю Иг-стадию снова наблюдается конденсация хроматина, но связанная уже с формированием профазных хромосом.

Постепенное уменьшение количества конденсированного хро­ матина при переходе клеток из Gi-периода в S-период и последую­ щее увеличение количества гетеропикнотического хроматина по мере приближения клеток к митозу, показано на клетках HeLa, у которых ядра характеризуются вообще малой степенью конденса­ ции хроматина (Erlandson, Harven, 1971). Такую динамику изме­ нения хроматина на ядрах низкодифференцированных клеток все же проследить удается не всегда (Blondel, Tolmach, 1965).

В растительных клетках с хромонемной структурой ядер Лафонтэн и Лорд (Lafontaine, Lord, 1969) отмечали утолщение конденсированных сегментов хроматина в S-периоде в два раза

по сравнению с Gi-периодом. С другой стороны, в клетках мери­ стемы корешка Crepis capillaris (Kuroiwa, Tanaka, 1969) в S-пе­ риоде наблюдается максимальная дезагрегация хроматина. У Allium flavum (Nagl, 1970) при сопоставлении структуры ядер в G4- и йг-периодах отмечается утолщение и уплотнение хроматиновых нитей и увеличение массы гетеропикнотизированного хро­ матина после завершения синтеза ДНК.

По данным О. Е. Онищенко и Ю. С. Ченцова (1973), в кореш­ ках Allium fistulosum можно четко отличить ядра, находящиеся в периодах Gi и G2, по их размерам и по тимидиновой метке из массы ядер выделить ядра в S-периоде. В Gt-периоде в ядре хоро­ шо видны нити конденсированного хроматина (хромонемы) не­ постоянной толщины (в среднем 0,25 мк) и протяженности, а также пристеночные крупные теломерные хромоцентры. В ядрах, где происходит синтез ДНК, наблюдается сильное разрыхление нитчатых хромонем. В постсинтетический период толщина хроматиновых нитей возрастает до 0,3 — 0,35 мк, величина перифериче­ ских хромоцентров увеличивается почти вдвое. Позднее в ядрах наблюдается препрофазная организация хроматина, приводящая к образованию митотических хромосом (табл. 11, 12).

Эти немногочисленные наблюдения за ультраструктурными изменениями хроматина в течение жизненного цикла клеток, как нам представляется, свидетельствуют о следующей особенности структуры ядра: при синтезе ДНК наблюдается уменьшение чис­ ла зон конденсированного хроматина, которое вновь возрастает в постсинтетическом периоде, что может быть связано с переходом клеток к митозу.

II.СТРУКТУРА И ХИМИЯ ЯДРЫШКА КАК ОРГАНОИДА СИНТЕЗА КЛЕТОЧНЫХ РИБОСОМ

ниях клеток дали в свое время Касперсону возможность выдвинуть гипотезу о «системе образования цитоплазматических белков» (Caspersson, 1956). Суть ее заключалась в следующем. Часть хроматипа ядра обладает специфической функцией образования боль­ шого количества белков, которые собираются в ядрышке. Затем эти белки вызывают процесс синтеза цитоплазматической РНК, при участии которой происходит синтез белков цитоплазмы. Эта гипо­ теза получила множество подтверждений как в гистохимических, так и в биохимических работах, которые указывали на прямую связь между поведением ядрышка и интенсивностью синтетических процессов в клетке. Для всех интенсивно синтезирующих белки клеток, цитоплазма которых богата РНК, характерно появление крупных базофильных ядрышек. Такая картина встречается как в недифференцированных клетках эмбриональных, регенерирую­ щих или опухолевых тканей, способных к бурному росту и раз­ множению, так и у тех дифференцированных клеток, для которых свойственно образование большого количества белка (например, клетки железистого эпителия, нейроны, плазмоциты и т. п.)

В настоящее время известно, что в процессах синтеза клеточ­ ных белков ядрышко клетки является органоидом образования рибосомных РНК и рибосом, на которых происходит синтез полипептидных цепей как в ядре, так и в цитоплазме. В пользу этого представления говорит целый ряд фактов.

Можно представить себе схему участия ядрышек в синтезе цитоплазматических белков следующим образом: на ДНК ядрыш­ кового организатора образуется рибосомная РНК (рРНК), кото­ рая в зоне ядрышка одевается белком, здесь происходит сборка рибонуклеопротеидных частиц — рибосом; рибосомы, выходя из ядрышка в ядро или в цитоплазму, участвуют в процессах синте­ за белка (Franklin, Baltimore, 1962).

Количество ядрышек в клетке

Начиная от зеленых водорослей, грибов н низших простейших и кончая высшими организмами, все клетки имеют обязательные рнутриядерные структуры — ядрышки (Sirlin, 1962). Это правило