книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

92 Интерфазное ядро

ядром и цитоплазмой устанавливается полное равновесие. Как в цитоплазматической, так и в ядерных фракциях клеток печени найдено примерно одинаковое количество АТФ, метаболитов гли­ колиза и других ферментов, коферментов и метаболитов (Siebert, Humphrey, 1965). Высокую проницаемость ядерной оболочки под­ тверждают наблюдения о том, что в выделенные ядра свободно проникают такие высокомолекулярные соединения, как гистоны и протамины (Goldstein, 1964), а также рибонуклеаза (Brachet, 1955).

Введение меченых аминокислот в организм крысы показало, что в клетках печени между ядром и цитоплазмой вскоре после введения устанавливается полное равновесие (Зиберт, 1972).

Эти наблюдения позволили Зиберту (1972) высказать предпо­ ложение, что так называемая «растворимая фаза» ядра и соот­ ветствующая цитоплазматическая фракция представляют собой единую систему, т. е. ядерная оболочка не создает диффузионного барьера в обмене между ядром и цитоплазмой. Однако наблюда­ лось, что для некоторых веществ равновесие между ядром и цито­ плазмой отсутствует. По данным того же Зиберта (1972), исклю­ чительно ядерную локализацию имеет НАД-пирофосфорилаза. Для лактатдегидрогеназы показано, что ядерный и цитоплазмати­ ческий ферменты представляют собой изоферменты (Vessel, Bearn, 1962). Анализ ядер, изолированных в безводных средах, показал, что в некоторых случаях ферментный состав ядра на­ столько отличается от ферментного состава цитоплазмы, что речь может идти о специальном внутриядерном фонде ферментов

(Stern, Mirsky, 1953).

С другой стороны, установлено, что из ядра в цитоплазму пе­ реходит только часть тех РНК, которые синтезировались в ядре (Георгиев, 1967), т. е. для некоторых макромолекул ядерная обо­ лочка является «непроницаемой».

Это свойство ядерной оболочки избирательно задерживать не­ которые вещества, по-видимому, частично сохраняется и в изоли­ рованных ядрах.

Так, меченый инулин не проникает в ядра печени крысы (Des­ mond, 1967). Оболочка выделенных ядер непроницаема, также для таких веществ, как нуклеотиды и трикарбоновые кислоты (Геор­ гиев, 1972). Проникновение в изолированные ядра аминокислот нельзя объяснить и простой диффузией, поскольку этот процесс зависит от снабжения энергией в виде АТФ (Георгиев, 1972). До­ бавление АТФ способствует также усиленному выходу из ядра информационной РНК (Ishikawa et al., 1969).

Выше говорилось, что место наибольшей активности АТФазы — ядерная оболочка, а преимущественная локализация этого фермента открывается в области ядерных пор (Делекторская, Перевощикова, 1969; Збарский, 1972).

Если все перечисленные факты свести воедино, возникает предположение, что именно ядерная оболочка обладает механиз­ мом, осуществляющим активный транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой. С другой стороны, существование внутри­ ядерного фонда некоторых веществ говорит о том, что ядерной оболочке может принадлежать функция регуляция транспорта цитоплазматических и ядерных продуктов. По-видимому, функ­ цию ограничения свободной диффузии несут мембранные элемен­ ты оболочки ядра, тогда как местом активного транспорта являют­ ся ядерные поры.

В пользу этого предположения имеются экспериментальные данные, которые показывают, что именно через ядерные поры мо­ гут проникать крупные частицы, по своим размерам вполне сопо­ ставимые с теми макромолекулами, которые обмениваются между ядром и цитоплазмой.

В этих экспериментах в цитоплазму интерфазных клеток амеб вводили раствор коллоидного золота, и через разные сроки после инъекции клетки фиксировали для электронномикроскопического изучения (Feldherr, 1965). Как оказалось, частицы коллоидного золота первоначально избирательно накапливаются в области ядерных пор, а затем переходят в кариоплазму. По скорости про­ никновения частиц в ядро можно судить о том, что прохождение частиц через пору происходит не за счет простой диффузии, а ско­ рее в результате их активного переноса материалом поры. Как показывает измерение диаметров частиц, проникающих в ядро и оставшихся в цитоплазме, материал поры способен как бы «сор­ тировать» частицы по их размерам — основная масса гранул, про­ никших в ядро, имеет диаметр 85 А, тогда как более крупные ча­ стицы преимущественно остаются в цитоплазме.

В другой серии экспериментов этого же автора было показано, что ядерная оболочка амеб способна изменять свою проницае­ мость. Когда коллоидное золото инъецировалось в цитоплазму профазных клеток, заметно увеличивалась скорость проникнове­ ния частиц в ядро. Больше того, в ядре оказывалось гораздо боль­ шее количество частиц размером 105—140 А, которые преобладали в цитоплазме интерфазных клеток (Feldherr, 1968).

Как нам представляется, эти эксперименты дают две группы фактов, важных для понимания функциональных особенностей ядерной оболочки. Прежде всего, они показывают, что ядерные поры действительно могут служить каналами для транспорта ча­ стиц, имеющих достаточно большие размеры. Второй важный вы­ вод состоит в том, что прохождение частиц через ядерные поры происходит не путем диффузии, а за счет их активного перено­ са компонентами поросомы.

Однако различные модельные эксперименты хотя и демонст­ рируют функциональные возможности пор, но все же далеки от

94 Интерфазное ядро

той ситуации, которая имеет место в живой клетке. Поэтому, прежде чем делать окончательные выводы о функциональной ро­ ли пор, необходимо рассмотреть доказательства в пользу того, что и в условиях интактной клетки именно через поры осуществля­ ется транспорт макромолекул. Надо признать, что на этот счет имеются гораздо более скудные и противоречивые данные.

Пожалуй, наиболее убедительно выглядят доказательства в пользу транспорта через пору крупных перихроматиновых гранул РНП диаметром около 450—500 А. Некоторые авторы описывают непосредственное включение перихроматиновых гранул в ком­ плекс поры и их последующий выход в цитоплазму (Stevens, Swift, 1966; Cole, 1969; Stevens, Andre, 1969; Franke, Scheer, 1970).

По другим данным, путь перихроматиновых частиц можно проследить только до зоны ядерных пор. По мере приближения к поре происходит изменение конфигурации частиц, которое выра­ жается в их утонынении или вытягивании в тонкие фибриллярные

(Monneron, Bernhard, 1969) или палочковидные структуры (Ste­ vens, Swift, 1966; Franke, Scheer, 1970). Имеются некоторые кос­ венные данные в пользу того, что центральная гранула поры, так же как и перихроматиновые частицы, представляет собой РНП, транспортирующуюся в цитоплазму.

Так, по наблюдениям Франке, количество пор, содержащих центральную гранулу, уменьшается в процессе роста ооцитов Triturus alpiensis, что совпадает с понижением общей метаболичес­ кой активности ядра (Franke, Scheer, 1970). Воздействие актиномицином в концентрации, блокирующей синтез рибосомной РНК, также вызывает уменьшение количества пор, содержащих цен­ тральную гранулу. Сходную картину можно наблюдать на примере оболочки макронуклеуса Tetrahymena piriformis (Wunderlich, 1969). В оболочке макронуклеуса этой инфузории доля пор, со­ держащих центральную гранулу, значительно увеличивается в кон­ це деления, что совпадает с возрастанием синтеза рибосомной РНК. Как и в ооцитах тритона, актиномицин вызывает уменьшение чис­ ла пор с центральной гранулой (Wunderlich, 1969). Корреляция между активностью ядра и количеством пор, содержащих централь­ ную гранулу, обнаружена также в клетках культуры ткани HeLa (Comes, Franke, 1970).

Эта группа данных служит доводом в пользу той точки зрения, что центральная гранула представляет собой РНК в стадии пере­ хода в цитоплазму. Наиболее полное развитие эта точка зрения получила в гипотезе, согласно которой через ядерные поры осуще­ ствляется активный транспорт РНК (Wunderlich, 1972). По пред­ положению этого автора, комплекс поры может находиться в двух структурных состояниях — закрытом и открытом. В отсутствие транспорта РНК-частиц структурные элементы поросомы распо­

зация соответствует закрытому состоянию поры. Контактируя с комплексом поры, частицы РНП индуцируют структурные пере­ стройки поросомы, канал открывается, пропуская макромолекулы в цитоплазму. Так как транспорт РНК в цитоплазму идет против концентрационного градиента и стимулируется добавлением АТФ (Ishikawa et al.. 1970), автор приходит к выводу именно об ак­ тивном переносе молекул РНК в области пор. Эти данные хорошо соответствуют тем представлениям об активном участии материа­ ла пор в транспорте макромолекул, которые развивает Фельдеер па основе своих опытов по проникновению в ядро коллоидного золота

(Feldherr, 1966).

Изложенная гипотеза интересна еще и тем, что в ней дается представление о тех возможных механизмах, при помощи которых оболочка ядра участвует в метаболизме РНК, и хотя представле­ ния автора о центральной грануле как о продукте хромосомной активности не являются окончательно доказанными, точка зрения о способности поры менять свое функциональное состояние нахо­ дит поддержку.

На существование пор, «открытых» и «закрытых» для транс­ порта веществ, указывалось в некоторых других работах (Moor, Miihlethaler, 1963; Stevens, Andre, 1969; Kessel, 1969). Функция

«клапана», регулирующего просвет поры, приписывалась элемен­ там поросомы (Du Praw, 1969), гранулярным компонентам комп­ лекса (Kessel, 1969) и т. п.

В структурных перестройках поросомы, в ее переходе от зак­ рытого к открытому состоянию можно видеть один из механизмов, регулирующих ядерно-цитоплазматические взаимоотношения.

Возможны и другие пути регуляции обмена между ядром и ци­ топлазмой. Не исключено, что интенсивность транспорта через ядерную оболочку может регулироваться количеством пор. В этом отношении показательно сравнение различных типов клеток, от­ личающихся уровнем метаболической активности. В ооцитах неко­ торых амфибий и рыб поры занимают от 25 до 50% ядерной по­ верхности, что говорит о чрезвычайно интенсивном потоке ве­ ществ через оболочку ядра (Ченцов, 1967). В то же время в клет­ ках HeLa на долю пор приходится только 5% ядерной поверх­ ности.

Количество пор уменьшается также при дифференцировке кле­ ток, связанной с частичной или полной инактивацией ядра. Это

явление особенно ярко проявляется при сперматогенезе (Stevens, Andre, 1969) и дифференцировке эритроидных клеток (Grasso et al., 1962). В тех работах, где подсчет числа пор на ядро сопро­ вождался количественным определением ядерной активности, пря­ мо показана зависимость количества пор от метаболической актив­ ности ядра (Scott et al., 1971; Maul et al., 1972). Авторы этих pa-

96 Интерфазное ядро

бот приходят к выводу, что увеличение количества пор отражает интенсификацию ядерно-цитоплазматических взаимоотношений

(Maul et al, 1972).

Возможен и третий путь поступления продуктов ядерной ак­ тивности в цитоплазму, в который вовлекаются не только поры, но и мембранные компоненты оболочки ядра.

При помощи световой и электронной микроскопии удается наблюдать выход из ядра в цитоплазму ядрышек и даже скопле­ ний хроматина (Anderson, Beams, 1956; Лев, 1966; Kessel, Beams, 1969), что сопровождается локальными разрывами ядерной мем­ браны (Albanese, 1964; Scharrer, Wurzelmann, 1969). В некоторых специализированных клетках, таких, как шелкоотделительные же­ лезы насекомых, небольшие фрагменты лопастного ядра способны отшнуровываться и затем лизироваться в цитоплазме (Tashiro

et al., 1968).

В других случаях удавалось наблюдать отделение от наружной ядерной мембраны многочисленных пузырьков, заполненных элек­ тронноплотным содержимым, что, по мнению авторов, является при­ мером ядерной секреции (Gouranton, 1969).

Функциональное значение такого, можно сказать, аномального поведения ядерной оболочки остается неясным. Вероятно, выход большого количества веществ из ядра диктуется потребностями цитоплазмы в продуктах ядерной активности (Szollosi, 1965; Ta­ shiro et al., 1968).

Суммируя данные об участии оболочки ядра в ядерно-цито­ плазматических взаимоотношениях, можно прийти к определен­ ным выводам как о функции ядерной оболочки в целом, так и о роли ее отдельных компонентов. В настоящее время накопилось много фактического материала в пользу того, что функции мем­ бранных элементов оболочки ядра состоят в ограничении свобод­ ной диффузии макромолекул между ядром и цитоплазмой. В тех ограниченных случаях, когда из ядра в цитоплазму переходят круппые структуры — целые ядрышки или глыбки хроматина, це­ лостность мембран оболочки ядра может нарушаться. Однако та­ кой путь выхода продуктов ядерной активности, по-видимому, является исключением и имеет место лишь у ограниченного типа клеток. В обычных условиях функцию транспорта макромолекул несут ядерные поры, вернее, те немембранные компоненты норо­ вого комплекса, которые мы называем поросомой. Относительно механизма действия поросомы как системы, избирательно регули­ рующей транспорт макромолекул, до сих пор нет единого мнения. Изменения структуры норового комплекса, коррелирующие с функ­ циональным состоянием ядра, позволяют высказать предположе­ ние о двух возможных структурных и функциональных состояни­ ях поросомы — открытом для транспорта макромолекул и закры­ том. Возможпо, роль пускового механизма, вызывающего пере­

Интерфазное ядро

таких каналов не показано, так что предложенный Зибертом ме­ таболический путь остается гипотетичным.

Из других важных функций ядерной оболочки можно отметить ее функции, связанные с ядерным окислением и окислительным фосфорилированием. Данные, полученные И. Б. Збарским и сотр. (1972), свидетельствуют о том, что изолированные ядерные оболочки обладают высокой дыхательной активностью, которая сравнима с дыхательной активностью митохондрий. В некоторых отношениях (наличие окислительных ферментов, цитохромов, поглощение кислорода и торможение дыхания классическими ин­ гибиторами) ядерная окислительная система напоминает мито­ хондриальную. Однако есть данные, указывающие на своеобра­ зие ядерных энергетических систем — например, во фракции ядерных оболочек не окисляется сукцинат, а в качестве субстра­ тов дыхания ядра используют жирные кислоты.

100 Судьба компонентов ядра в митозе

Tradescantia увидели в ранней профазе несколько порядков про­ дольных спирально расположенных волокон. Согласно их данным, каждая хроматида подразделялась на две вторичные, или полухроматиды, и каждая из этих последних в свою очередь подразделя­ лась на более низкие порядки хромонемных пар.

Многонитчатость в организации была обнаружена также при изучении боковых петель мейотических хромосом типа ламповых щеток у амфибий (Lafontaine, Ris, 1958). Исследуя в электронном микроскопе выделенпые лептотенные хромосомы лилий, Рис (Ris, 1957) обнаружил в межхромомерных участках до 8 элементарных нитей, в боковых петлях хромосом типа ламповых щеток у Necturus их число доходило до 16. В связи с этим было высказано предположение, что хромосомы представляют собой пучок из мно­ гих элементарных нитей, общее число которых кратно двум.

Одновременно с Рисом такую же точку зрения высказали мно­ гие исследователи. Так, Кауфман и Мак-Дональд (Kaufmann, McDonald, 1956), исследуя серии фотографий и произведя по ним реконструкцию, обнаружили по крайней мере 64 вспомогательных (вторичных) нити в профазной хромосоме, которые, образуя пар­ ные пары, входят в состав хромонем.

Сходные взгляды высказываются в работе Шигенага (Shigenaga, 1956): хромосомы образованы спирально скрученными хромонемами; каждая хромонема состоит из двух взаимно спирализованных хромонем второго порядка, каждая из которых образована двумя спирализованными хромонемами третьего порядка. Автор доходит до нитей толщиной 100—200 А, являющихся хромонемами шестого порядка.

Другое объяснение миогонитчатости в структуре хромосом мож­ но получить из представления об иерархии спиралей. По мнению Амано и др. (Amano et al., 1956), хромосома состоит из целого ряда спирально закрученных протохромонем толщиной около 20—30 А. Протохромонема, спирализуясь, образует субхромонему (260—300 А), которая, в свою очередь, спирально скручиваясь, образует хромонему. Несколько хромонем, также взаимно пере­ виваясь, образуют хромосому. Аналогичные схемы приводятся в работе Бопп-Хассенкамп (Ropp-Hassenkamp, 1959).

Так или иначе большинство исследователей подтверждали многонитчатую организацию хромосом. Эти представления выли­ лись в хорошо известную схему организации хромосом по принци­ пу «спаривания пар» ее структурных элементов (Ris, 1957; Steffensen, 1960). По этой схеме каждая хромосома состоит из двух хроматид, каждая из которых состоит из двух полухроматид. Полухроматида содержит две фибриллы толщиной по 200 А каж­

нуклеогистоновых молекул толщиной по 35—40 А. Следовательно,

хромосома должна состоять по крайней мере из 32 элементарных нитей ДНП располагающихся вдоль хромосомы и организованных по типу скрученной веревки.

Хотя эти взгляды и представления ошеломляли своей слож­ ностью, они все же являлись лишь несколько усложненными ва­ риантами представлений о многонитчатой природе хромосом, изве­ стных цитологам уже с 30-х годов. Эти взгляды имели не только морфологические доказательства, они хорошо согласовывались с цитологическими и генетическими наблюдениями — такими, как полу- и четвертьхроматидные разрывы хромосом (Swanson et al., 1967), отдаленные по времени проявления хромосомных наруше­ ний и т. д. Однако они не могли объяснить такие процессы, как мутагенез и кроссинговер, так же как не могли ответить на многие вопросы о структуре хромосомы в целом. Поэтому, несмотря на подтверждение точки зрения сторонников многонитчатой органи­ зации хромосом (Ris, 1957; Kaufmann et al., 1960; Cole. 1962; Osgood et al., 1964), появились скептические высказывания в ад­ рес этой гипотезы (Moses, 1964; Hyde 1965), которые основыва­ лись также на фактическом материале, полученном без помощи электронного микроскопа.

Голл (Gall, 1955, 1963а) в своих работах по изучению мейотических хромосом типа ламповых щеток пришел к заключению, что боковые петли таких хромосом состоят из десппрализованной хро­ монемы, содержащей одну нить ДНП диаметром около 100 А. Тело Же профазной хромосомы составляют две хроматиды, каждая из ко­ торых представляет собой одиночную длинную молекулу пли цепь молекул ДНП. Эти молекулы ДНП спирализуются, что приводит к образованию конденсированных участков — хромомеров. На опре­ деленных участках каждая хроматида образует боковые петли за счет деспирализации хромомерных участков. Следовательно, каж­ дая анафазная хромосома — хроматида — должна быть образована одной длинной, непрерывной питью ДНП, заключающей в себе одну молекулу или цепь молекул ДНК. В пользу этих представле­ ний приводились наблюдения за динамикой ДНК-азного перевари­ вания таких хромосом (Gall, 1963а), на основе которых делались заключения, что боковая петля образована одной молекулой ДНК, а тело профазной хромосомы — двумя. По мнению Хэддла и Бодикота (Heddle, Bodycote, 1969), кинетика ДНК-азного переварива­ ния хромосом типа ламповых щеток более сложная, чем это считает Голл. Их результаты скорее говорят в пользу многонитчатости, чем однонитчатости этих хромосом. Представления Голла как будто бы подтверждались электронномикроскопическими наблюдениями Миллера (Miller, 1965), что осевым элементом петли является оди­ ночная молекула ДНК. Интересно, что в работе Сеппа (Sapp, 1966) приводятся данные, говорящие о том, что после переварива­ ния хромосом типа ламповых щеток трипсином и РНК-азой в