книги из ГПНТБ / Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра

142 Судьба компонентов ядра в митозе

пуффы личинок Chironomus, такие, как кольца Бальбиани I и II па IV хромосоме, так же как мелкие пуффы, состоят в основном из однообразных РНП-гранул, имеющих сходный размер н мор­ фологию. Аналогичного характера гранулы встречаются в интер­ фазных, метаболически активных ядрах.

В отличие от этих гранулярных структур, характерных для мест активного синтеза на хромосомах, структура элементов мат­ рикса митотических хромосом растений и животных резко отли­ чается.

Поэтому, суммируя эти наблюдения, мы вправе говорить о том, что матрикс митотических хромосом не представляет собой про­ дукта возобновления синтетической активности хромосом.

С другой стороны, мы склонны считать, что этот матрикс пред­ ставляет собой продукт хромосомной активности, переносимый и перераспределяемый хромосомами во время митоза, но синтези­ рованный ранее, до профазы митоза.

Скорее всего образование матрикса, его поведение во время митоза можно связать с циклом изменения и возникновения яд­ рышка. Здесь необходимо лишь вкратце остановиться на общих соображениях в пользу этой возможности: 1) матрикс выяв­ ляется в хромосомах после исчезновения ядрышка в профазе; 2) ядрышко и матрикс содержат РНК. Некоторые биохимические наблюдения показывают, что РНК метафазных хромосом (Maio, Schildkraut, 1967) и ядрышка (Perry, 1963) принадлежит к рибо-

сомному типу (рРНК); 3) сходство элементов матрикса и ядрыш­ ка —в их состав входят тонкие фибриллы и рибосомоподобные частицы; 4) генезис ядрышка после митоза связан с обособлением фибриллярного компонента на поверхности хромосом (см. ниже); 5) возникновение первичных ядрышковых структур после ми­ тоза, по всей вероятности, не связано с возобновлением синтеза рРНК.

Во всяком случае, можно согласиться с мнением Ж. Браше (1960), что нет ничего невозможного в том, что важнейшие со­ ставные части ядрышек распределяются равномерно между до­ черними клетками. Скорее всего матрикс представляет собой фор­ му такого перераспределения.

Вероятно, что этим роль матрикса не ограничивается. Факт взаимосвязи между выявлением матрикса и деспирализацией ми­ тотических хромосом может служить подтверждением мнения о его роли в процессе спирализации хромосом (Serra, 1949). Кроме того, не исключено, что часть материала матрикса идет на обра­ зование компонентов ядерного сока, а именно на восстановление и развитие внутриядерной рибонуклеопротеидной сети (Smetana et al., 1963). Таким образом, анализируя структуру и поведение матрикса митотических хромосом, мы связываем его по многим признакам с материалом ядрышка.

VII. СУДЬБА ЯДРЫШКА ПРИ ДЕЛЕНИИ КЛЕТОК

Известно, что ядрышко исчезает в профазе и появляется вновь в средней телофазе. В этот период от растворения ядрышка до его появления в клетках не происходит синтеза РНК. Процесс исчезновения ядрышка как плотной структуры еще недостаточно исследован с помощью электронного микроскопа. Лафонтен и Лорд (Lafontaine, Lord, 1969) пишут, что в поздней профазе у некоторых растений оба ядрышковых компонента, фибриллярный и гранулярный, диспергируются в содержимом ядра и заполняют зоны между хромосомами. Такая же картина наблюдается и в клетках животных (Brinkley, 1965; Chang, Gibley, 1968; Noel et al., 1971): ядрышко уменьшается в объеме, падает количество гранул, фибриллярный компонент распадается на ряд мелких

рыхлых глыбок.

Появление ядрышка совпадает с восстановлением способности клеток синтезировать РНК. Эти наблюдения, казалось бы, прямо указывают на то, что ядрышко является структурой, возникаю­ щей в результате синтетической активности хромосом (Swift, 1965). Однако имеется целый ряд исследований, которые пока­ зывают, что элементы ядрышка не исчезают полностью после профазы, а могут передаваться от ядра к ядру во время митоза. В связи с этим существует несколько предположений относитель­ но генезиса ядрышка после деления клетки: 1) ядрышко соби­ рается в структуру из предсуществовавших элементов на опре­ деленных участках хромосом; 2) ядрышко возникает заново в результате синтетической деятельности хромосом; 3) при образо­

вании ядрышка имеют место оба эти процесса.

В пользу первой возможности говорят многие данные. Так, Кусанаги (Knsanagi, 1964) метил клетки проростков ожики Н3-цптидином в течение 10 мин. (за это время метка успевала накапливаться только в ядрышке), а затем переносил их в нера­ диоактивную среду. После такой смены метка обнаруживалась через 30 мин. в зоне метафазных хромосом, а через 40 мин,— в анафазных хромосомах. Сходные результаты получены на раз­ нообразных объектах другими авторами (La Cour, 1963; Feinendegen, 1963), показавшими, что меченая РНК ядрышка после его исчезновения в профазе может переходить в хромосомы и пере­

носиться в дочерние ядра.

В многочисленных цитологических исследованиях, где исполь­ зовались специальные приемы выявления ядрышек (импрегиацня

144 Судьба компонентов ядра в митозе

серебром) или гистохимические методы, также приводятся све­ дения о возможности переноса материала ядрышек хромосомами

Das, 1962; Hsu et al., 1965; Кикнадзе, 1962; Беляева, Волкова,

фазных клетках только в ядрышках; в профазе, а затем в мета­ фазе и анафазе можно было видеть некоторое количество отло­ женного серебра и на хромосомах. В телофазе по мере образования дочерних ядер хромосомы теряют аргентофильное вещество, кото­ рое обнаруживается теперь в новообразующихся ядрышках. Тот факт, что аргентофильное вещество (возможно, ядрышковой при­ роды) обнаруживается на всех хромосомах по всей их длине, наво­ дит на мысль, что ядрышковые вещества переносятся всеми хро­ мосомами.

Существуют электронномикроскопические наблюдения о при­ сутствии элементов ядрышка в течение всего митоза. Так, на культуре клеток китайского хомячка Бринкли (Brinkley, 1965) обнаружил рыхлый ядрышковый материал, связанный с поверх­ ностью хромосом па всех стадиях митоза. На основании этого он предполагает, что ядрышко является структурой, которая остается связанной с хромосомами в митозе и переносится в дочерние ядра, чтобы служить или первичным ядрышковым материалом, или быть источником РНК в молодых клетках, пока не образуется но­ вое ядрышко. Сю и др. (Hsu et al., 1967) на культуре клеток крысиной кенгуру обнаружили, что в зоне вторичной перетяжки метафазных хромосом сохраняется фибриллярный материал та­ кой же морфологии, как у фибриллярных частей ядрышка. Яд­ рышковые компоненты были прослежены на всех фазах митоза у опухолевых клеток (Chang, Gibley, 1968) и у Spirogira (Jordan, Godward, 1969). В последнем случае ядрышко не исчезает, а об­ волакивает массу хромосом и вместе с ними переносится в дочер­ ние ядра. Сю и др. (Hsu et al., 1965) во время митоза в клетках, где не было видно оформленного ядрышка, наблюдали небольшие массы ядрышковых компонентов, примыкавших к хромосомам и двигавшихся с ними в течение митоза.

По нашему мнению, материал матрикса хромосом, который выявляется, начиная с метафазы, представляет собой часть ком­ понентов ядрышка, переносимых хромосомами в дочерние клетки. В телофазе процесс образования ядрышек описан более подробно

(Lafontaine, 1968; Lafontaine, Lord, 1969). В телофазе на поверх­ ности хромосом во многих местах начинают наблюдаться неболь­ шие плотные зоны, состоящие из грапул диаметром 150 А и тон­ ких фибрилл. По мере деспирализации и разрыхления хромосом в телофазных ядрах эти плотные участки (предъядрышки) соби­ раются в межхромосомных зонах и, сливаясь, образуют типичные ядрышки. Лафонтен (Lafontaine, 1968) считает эту динамику

появления ядрышка результатом возобновления синтетической активности хромосом. В своем обзоре Лафонтен и Лорд (Lafontaine, Lord, 1969) пишут, что они наблюдали включение меченых предшественников РНК в телофазные ядра с еще спирализованными хромосомами и многочисленными предъядрышками.

Как нам представляется, более вероятна третья возможность. Ядрышко образуется в телофазных ядрах в результате двух про­ цессов: 1) образования неактивных предъядрышек за счет пере­ носа их материала хромосомами; 2) перехода предъядрышек в дефинитивные ядрышки при возобновлении синтеза рРНК. Эта возможность может быть проверена экспериментально путем по­ давления синтеза основных компонентов ядрышка, т. е. РНК и белка.

Как известно, низкие дозы актиномицина (0,05 мкг/мл), по­ давляя синтез рибосомиой РНК клеток (Perry, 1964), не влияют значительно на процесс деления клеток. Поэтому можно следить за делением клеток в культуре ткани и развитием в них ядрышек при добавлении к среде актиномицина. Для этого использовали клетки перевивной культуры почек свиньи, которые удобны для прижизненных наблюдений тем, что во время митоза они незна­ чительно меняют форму, и поэтому все фазы деления и судьба ядер прослеживаются отчетливо (Ченцов, Андреев, 1963; Ченцов, 1966).

Чтобы возможно точнее проследить во времени стадии образо­ вания ядрышек в норме и в опытах, отыскивали клетки, находя­ щиеся в стадии метафазы. Момент расхождения хромосом в начале анафазы принимали за нулевую точку, от которой отсчи­ тывали время прохождения последующих изменений клетки и ее ядерных структур.

В норме процесс расхождения хромосом к полюсам завер­ шается за 4—5 мин. после начала отсчета; клеточная перетяжка появляется на 7—8-й мин.; к 10—12-й мин. заканчивается цито­ кинез и начинают набухать телофазные скопления хромосом — начало реконструкции ядер. Первые признаки ядрышек появля­ ются на 20—22-й мин. после начала анафазы. Они представлены многочисленными (4—6) темными гранулами («предъядрышки»), которые постепенно увеличиваются в размерах, могут сливаться и давать начало крупным ядрышкам реконструированных ядер (см. табл. 43, а, б, в). Часть предъядрышек (1—2) не сливаются, а просто растут до размеров ядрышек интерфазных ядер. Эти про­ цессы прослеживаются при цейтраферной киносьемке. При элек­ тронномикроскопическом исследовании клеток начиная с 15— 18 мин. в ядрах, кроме материала разрыхленных хромосом, встре­ чаются скопления фибриллярного материала в виде достаточно крупных участков (0,5—1 мк) (см. табл. 43, г). Количество таких Участков на сечение ядра может достигать 2—4, они состоят из

146 Судьба компонентов ядра в митозе

рыхло расположенных осмиофильных тонких фибрилл толщиной 40—80 А; иногда в таких фибриллярных участках встречаются зоны дополнительного разрыхления. Окраска подобных клеток метилгрюн-пиронином обнаруживает в их ядрах до 5—6 базофильных структур в виде мелких гранул. В дальнейшем (20—25 мин.) структура таких предъядрышек значительно не меняется, только по периферии появляется гранулярный компонент, сходный с та­ ковым в дефинитивных ядрышках. Одновременно с этим предъядрышки увеличиваются в размере, мелкие фибриллярные скоп­ ления в остальном ядре постепенно исчезают. К 30 мип. наблюде­ ния в ядрах дочерних клеток уже видны крупные (до 1—1,5 мк) ядрышки, состоящие из многочисленных, рыхло расположенных фибрилл, между которыми разбросаны многочисленные гранулы величиной 150—200 А (см. табл. 43,5). К 40—60 мин. в структуре ядрышек дочерних клеток обнаруживаются пряди типа нуклеолонемы, и они практически не отличаются от ядрышек окружающих интерфазных клеток. Следовательно, при нормальном образова­ нии ядрышек фибриллярная фаза сменяется смешанно-грануляр­ ной, что отображает, по нашим представлениям, начало синтеза рРНК на хромосомах. В это же время ядрышки начинают расти.

Последовательность экспериментов с актиномиципом была следующая. В камеру с клетками вводили актиномицин (0,05 мкг на 1 мл инкубационной среды). Через час после введения актиномицина, когда подавляется синтез рибосомной РНК, выбирали для наблюдения клетки на стадии метафазы; их дальнейшее по­ ведение прослеживали визуально и с помощью цейтраферной мик­ рокиносъемки. При данной дозе актиномицина клетки культуры продолжали делиться в течение нескольких часов. Продолжитель­ ность стадий митоза после начала анафазы была такая же, как и в нормальных, контрольных клетках, за исключением времени развития ядрышка. Клетки нормально делились, ядра в них ре­ конструировались, в них возникали предъядрышки приблизитель­ но в том же количестве, что и в норме, однако их роста и разви­ тия в ядрышки интерфазного типа не происходило (см. табл. 44, а, б, в, г) . Если в контроле на 30-й мин. ядрышки уже имеют вид плотных и довольно крупных внутриядерных включений, то к этому времени в клетках, обработанных актиномицином, они едва заметны. Они не растут, не сливаются и остаются без изменений вплоть до 1,5—2 час. Ядра дочерних клеток к этому времени сильно увеличиваются, приближаясь по объему к ядрам в стадии интерфазы. Если эти разделившиеся в присутствии актиноми­ цина клетки окрасить метиловым зеленым с пиронином после фиксации их 70%-ным спиртом или 10%-ным нейтральным фор­ малином, то их многочисленные предъядрышки окрашиваются в красный цвет. Эта окраска снижается РНК-азой, что позволяет говорить о том, что базофилия этих структур связана с РНК. При

Если структуру клеток, за которыми мы наблюдали во время деления в течение 2 час. при действии на них актиномицином исследовать в электронном микроскопе, то в ядрах дочерних кле­ ток видны многочисленные (на срезах 2—6) плотные тельца, имеющие тонкофибриллярное строение (см. табл. 44, е, д). Срав­ нение топографии телец с прижизненными фотографиями пока­ зывает, что эти мелкие фибриллярные образования соответствуют микроядрышкам. Собственно ядрышковую структуру этих телец доказывает их способность к сегрегации при больших дозах актиномицина, как и настоящих ядрышек в любых интерфазных яд­ рах (см. табл. 45, б, в).

Если при проведении подобного эксперимента отмыть актиномицин через 20 мин. после начала расхождения хромосом в анафазе, т. е. когда хорошо видны микроядрышки, то в дочерних ядрах наступают изменения. Примерно через 2—3 часа некоторые ядрышки увеличиваются в размерах и разрыхляются. В их соста­ ве по периферии видны немногочисленные гранулы (150—200 А). Часть микроядрышек остается без изменений.

Сходные результаты получены при инактивации профазных ядрышек УФ-микролучом (Сахаров и др., 1972). В. К. Сахаров и Л. Н. Воронкова (1968) показали, что при облучении УФ-мик­ ролучом ядрышек в профазе клетки способны делиться, но в до­ черних ядрах вместо нормальных ядрышек видны многочисленные мелкие и плотные тельца —«предъядрышки». Можно было ожи­ дать, что такое повреждение ядрышка, связанное, очевидно, с на­ рушениями синтеза РНК (Perry, Еггега, 1960), приведет к появ­ лению структур, аналогичных тем, которые возникают при действии актиномицина на делящиеся клетки.

Облучению подвергали ядрышки клеток тех же культур, ко­ торые использовали в предыдущих экспериментах на стадии поздней профазы. Интенсивность облучения была подобрана та­ ким образом, чтобы не задерживался митоз и не подавлялось деление клетки. Площадь поперечного сечения микропучка соот­ ветствовала площади поперечного сечения ядрышка средней ве­ личины.

Образующиеся в результате облучения профазного ядрышка мелкие плотные тельца в дочерних ядрах существенно отлича­ ются от обычных ядрышек не только величиной и числом, но и структурой. Они представляют собой компактные образования, состоящие главным образом из тесно расположенных фибрилл толщиной 40—80 А (см. табл. 45, а). Эти мелкие внутриядерные тельца при окраске метиловым зеленым с пиронином красятся

в красный цвет (окраска снимается РНК-азой), не дают реакции Фёльгепа. Можно считать, что эти тельца содержат РНК и что их ультраструктурная организация сходна со структурой микро­ ядрышек, возникающих при делении клеток в присутствии актикомицина.

Как нам кажется, эти опыты однозначно показали, что в от­ сутствие синтеза рРНК на хромосомах в дочерних ядрах все равно возникают предъядрышковые структуры. Следовательно, образование таких предъядрышек не может быть связано с во­ зобновлением синтетических процессов на хромосомах в телофазе, как это предполагают некоторые авторы (Swift, 1963; Stevens, 1965). Следовательно, мы должны рассмотреть другую возмож­ ность, а именно возможность переноса ядрышковых компонентов хромосомами во время деления клетки. Сам факт появления в ядрах, ингибированных актиномицином, РНК-содержащих ядрыш­ ковых структур однозначно говорит в пользу этой гипотезы. Не­ давно появились исследования, подтверждающие наши наблюде­ ния. Так, Стивенс и Прескотт (Stevens, Prescott, 1971) при обработке синхронно делящихся амеб актиномицином наблюдали фибриллярные, базофильные, ядрышкоподобные тельца в ядрах

эмбриональных клеток китайского хомячка с помощью светового микроскопа также наблюдал в ядре клеток, разделившихся в при­ сутствии актиномицина, появление многочисленных базофильных ядрышкоподобных телец. Автор делает вывод, что и РНК и белок ядрышек, по-видимому, сохраняются в течение митоза, возможно, ассоциируясь с митотическими хромосомами, и эти элементы мо­ гут вновь собираться в функциональные ассоциаты в форме мор­ фологически дискретных ядрышек в конце телофазы.

Подводя итог этим наблюдениям, судьбу ядрышка в митозе можно представить себе следующим образом. По мере затухания синтеза рРНК в средней профазе происходит разрыхление ядрыш­ ка и выход готовых рибосом в кариоплазму, а затем и в цито­ плазму (см. табл. 46). При конденсации профазных хромосом фибриллярный компонент ядрышка и часть гранул тесно ассо­ циируют с их поверхностью, образуя основу матрикса митотиче­ ских хромосом. Этот фибриллярно-гранулярный материал, синте­ зированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней телофазе еще в отсутствие синтеза РНК по мере деконденсации хромосом происходит высвобождение компо­

структуре гранул РНП, а затем в становлении дефинитивной фор­ мы нормально функционирующего ядрышка (рис. 18).

Неясным остается роль ядрышкового организатора. Возможно, что первично в районе ядрышкового организатора происходит конденсация фибриллярного компонента, обособившегося от мно­ гих хромосом (Мирский, Осава, 1961; Беляева, Волкова, 1964). Активация же ядрышкового организатора как места матриц для синтеза рРНК приводит к развитию структуры активного яд­ рышка.

VIII. ПОВЕДЕНИЕ ЯДЁРНОЙ ОБОЛОЧКИ В МИТОЗЕ

Известно, что у большинства эукариот оболочка ядра перестает существовать как целостная структура во время деления клетки. Исключение представляют некоторые Protozoa и низшие расте­ ния, у которых кариокинез происходит внутри старой ядерной оболочки (Райков, 1967; Jenkins, 1967). Однако и в этих случаях, хотя в целом ядерная оболочка сохраняется, некоторые детали ее структурной организации могут изменяться. Так, во время деле­ ния Amoeba proteus во внешней мембране ядерной оболочки появ­ ляются многочисленные отверстия и исчезает zonula nucleum limitans (Feldherr, 1968). Аналогичные изменения в структуре оболочки происходят при делении микронуклеусов некоторых двуядерных инфузорий (Райков, 1967). Таким образом, можно говорить об определенном цикле ядерной оболочки в процессе деления клеток всех эукариот, подразумевая под этим те более или менее выраженные структурные перестройки, которые за­ трагивают как отдельные компоненты ядерной оболочки, так и всю оболочку в целом. В описании этих структурных изменений можно выделить три основных вопроса: распад оболочки, судьба ее отдельных компонентов в митозе и реорганизация оболочки вокруг дочерних ядер в телофазе. Надо сказать, что по каждому из этих частных вопросов, как и по всей проблеме в целом, име­ ется чрезвычайно мало фактического материала.

Распад оболочки ядра по времени совпадает с конденсацией хромосом, разрушением ядрышка и образованием веретена деле­ ния. Подробно процесс распада ядерной оболочки впервые описан Портером и Мачадо (Porter, Machado, 1960). По описаниям этих авторов, разрушение оболочки ядра начинается в ранней профазе с образования локальных разрывов, а затем, в поздней профазе, оболочка распадается на отдельные фрагменты, по своей форме и размерам напоминающиие пузырьки и вакуоли эндоплазмати­ ческого ретикулума. За последующие годы эти наблюдения нашли подтверждение во многих работах, так что большинство совре­ менных авторов именно таким образом представляют себе про­ цесс распада оболочки ядра (Gall, 1964; Chang, Gibley, 1968; Stevens, Andre, 1969; Поляков, 1970) (см. табл. 49). И, хотя со вре­ мени первых описаний распада оболочки ядра прошло более 10 лет, многие вопросы, которые возникают при попытке объяснить механизм этого процесса, до сих пор остаются без ответа. Прежде всего не ясно, в чем состоит причина распада ядерной оболоч­ ки — является ли разрушение оболочки ядра отражением тех про­ цессов, которые происходят в профазе с ядерными или цитоплаз­

матическими структурами, или же ее разрушение инициируется собственным, внутренним механизмом. Можно было бы предпо­ лагать, что целостность ядерной оболочки каким-то образом свя­ зана с состоянием хроматина: она начинает фрагментироваться после завершения конденсации митотических хромосом в про­ фазе. Однако в других случаях (в мейозе или в гигантских клет­ ках слюнных желез двукрылых), несмотря на то, что хромосомы полностью, или большей своей частью не контактируют с ядер­ ной оболочкой — она не разрушается и сохраняет все свои осо­ бенности, характерные для интерфазного ядра.

Не исключено, что распад оболочки ядра вызывают не ядерные, а цитоплазматические факторы. Так, по наблюдениям Байе­ ра, в профазе к ядерной оболочке подходят многочисленные мик­ ротрубочки веретена деления, которые оказывают давление на ядро, вызывая тем самым локальные разрывы мембран ядерной оболочки (Bajer, Mole-Bajer, 1969). Действительно, в зонах ядерпой оболочки, обращенных к центриоли, можно наблюдать боль­ шое количество микротрубочек, проходящих через разрывы в ядерных мембранах. Однако интересной гипотезе Байера противо­ речит тот факт, что распад ядерной оболочки происходит в клет­ ках, обработанных колхицином, когда микротрубочки веретена де­ ления разрушаются.

Другую причину распада ядерной оболочки видят Хенкок и Ризер. По их мнению, основанному главным образом на теоре­ тических рассуждениях, фактором разрыва ядерных мембран слу­ жит гистон богатый аргинином, который может высвобождаться из связи с хромосомами в профазе (Hancock, Ryser, 1967).

Косвенным подтверждением этой гипотезы служат экспери­ менты Фельдеера, в которых ядра интерфазных клеток Amoeba proteus пересаживали в делящиеся клетки, и наоборот, профазные ядра — в интерфазные клетки амёб. Как оказалось, оболочка интерфазных ядер, трансплантированных, в делящиеся амебы, не претерпевала существенных изменений. В то же время препрофазное ядро, пересаженное в цитоплазму интерфазной клетки, проходило все стадии, характерные для более поздних фаз митоза. По мнению автора, эти данные служат доводом в пользу ядерного происхождения фактора, вызывающего распад ядерной обо­ лочки, и тем самым подтверждают предположение Хенкока и Ри-

зера (Feldherr, 1968).

Еще меньше данных имеется о том, какова судьба отдельных компонентов ядерпой оболочки в митозе. Наиболее распростра­ ненное мнение состоит в том, что фрагменты распавшейся обо­ лочки ядра частично оттесняются к полюсам делящейся клетки митотическим веретеном, а частично рассеиваются в цитоплазме

(Porter, Machado, 1960; Gall, 1964; Stevens, Andre, 1969). По-

новому заставляют взглянуть на судьбу ядерной оболочки в ми­