книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

Если процесс денатурации идет в отсутствие меркаптоэтанола, то создается возможность окисления свободных SH-rpynn до дисульфидных мостиков, ковалентно связывающих полипептидные цепи. Этим можно объяснить тот факт, что обработка каталазы гуанидингидрохлоридом без меркаптоэтанола не при­ водит к снижению ее молекулярного веса, он равен 144 000 вме­ сто 59 000 в присутствии меркаптоэтанола [54].

При концентрации гуанидингидрохлорида ниже 5М диссоциа­ ция белков до полипептидных цепей может быть неполной. На­ пример, при возрастании концентрации гуанидингидрохлорида от

в 5М гуанидингидрохлориде с 0,1 М меркаптоэтанолом [54].

Фотографии сделаны через 46 и 78 мин после достижения скорости 59 780 об/мин. Опыт проводили в границеобразующей кювете клапанного типа. Угол наклона фазовой диа­ фрагмы 60°. Растворитель—67 мМ калий-натриевый фосфатный буфер, pH 7,6. Темпе­ ратура 20 °С.

0,25 до 2,0 М (в присутствии 0,1 М р-меркаптоэтанола при pH 6,3 и температуре 20 °С) коэффициент седиментации АТФ-креа- тинтрансфосфорилазы, изменялся от 5,1 до 1,9 S. При кон­

центрации гуанидингидрохлорида 0,25 М и ниже (в20и) = 5,1 S,

что характерно для ассоциированной формы молекулы; натив­ ный фермент имеет коэффициент седиментации $!>„ ш = 5,3 S'),

а также выше 2,0 М в растворе имеется только по одному компо­ ненту (полностью ассоциированная и полностью диссоциирован­ ная, 1,4 S, формы молекулы соответственно). В промежуточном диапазоне концентраций система, кроме того, проявляла тенден­ цию к образованию агрегатов с коэффициентами седиментации вблизи 20 S [148].

Оценка молекулярного веса требует знания удельного парци­ ального объема белка, v. Точность установления этой величины в значительной мере оказывает влияние на точность нахождения молекулярного веса. Опубликованные в научной литературе дан­ ные относительно влияния концентрированного гуанидингидро­ хлорида на величину v противоречивы. Кажущийся удельный парциальный объем ряда белков не изменяется или только слабо уменьшается в присутствии гуанидингидрохлорида; есть основа­ ние считать, что v для белков в 6 М гуанидингидрохлориде

вообще не сильно отличается от той же величины в разбавлен­ ных водных солевых растворах (ср. табл.З и работы [149—152]). Однако предположение о преимущественной гидратации попрежнему часто используется при учете отклонений, и, следо-

Таблица 3

УДЕЛЬНЫЙ ПАРЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕМ БЕЛКОВ и В НАТИВНОМ СОСТОЯНИИ И В РАСТВОРАХ ГУАНИДИНГИДРОХЛОРИДА ПРИ 25 °С

вательно, если представляется возможность, необходимо дока­ зывать, изменяется ли v белков в растворах гуанидингидрохлорида. Высокая плотность концентрированного раствора этого соединения по сравнению с разбавленными буферными раство­ рами при неточном определении приводит к получению довольно больших ошибок в члене (1 — пр) уравнения Сведберга и, сле­ довательно, в молекулярном весе. Например, отклонение v на 0,01 мл/г вызывает ошибку в 7% при определении молекуляр­ ного веса с использованием 5 М гуанидингидрохлорида; при применении буферного раствора ошибка составляет только 3%.

Измерение вязкости растворов полипептидных цепей при вы­ сокой концентрации гуанидингидрохлорида с р-меркаптоэтано- лом показывает, что характеристическая вязкость [т]] зависит от молекулярного веса таким образом, как это предсказывает тео­ рия для полимерных цепей в конформации статистического клуб­ ка [137, 146]. Молекулярный вес можно оценить по следующему уравнению:

где п — число мономерных единиц (аминокислотных остатков) на цепь; Мо — средний молекулярный вес мономерной единицы; К', К." к а — константы. Последняя константа имеет значения в интервале 0,5—0,8 для статистических клубков. Для полипептид­

соответствующего белку, будет наблюдаться так называемый солевой дополнительный градиент, происходящий от различия концентраций гуанидингидрохлорида в растворе с белком и в растворителе, используемом для создания искусственной границы.

Очистка гуанидингидрохлорида [156]

Перед использованием гуанидингидрохлорид следует перекристаллизовывать следующим образом: 250 г соли растворяют в 1 л горячего абсолютного этанола, раствор пропускают через активированный уголь для обесцвечивания и в случае необходи­ мости фильтруют на большой воронке с подогревом. К горячему раствору затем добавляют 500 мл бензола, смесь охлаждают и выдерживают на холоду в течение нескольких часов, прежде чем приступить к отделению игольчатых кристаллов гуанидин­ гидрохлорида. Иногда образуется желтая густоватая примесь в исходном образце, которую можно отмыть ацетоном.

Перекристаллизованный таким образом гуанидингидрохлорид обычно подвергают дополнительной перекристаллизации либо из почти кипящего метанола с последующим охлаждением смесью сухой лед — ацетон, либо из воды упариванием под вакуумом почти насыщенных при 40 °С водных растворов гуанидингдирохлорида. Окончательное высушивание кристаллов проводят в ва­ куум-эксикаторе над Р2О5.

Другой метод состоит в нейтрализации густой массы кристал­ лов гуанидинкарбоната после перекристаллизации из 50% эта­ нола, очищенной 10%-ной соляной кислотой pH 4,0. Раствор упаривают до получения кристаллов гуанидингидрохлорида. Ко­ нечный продукт довольно чистый, но по-прежнему требует пере­ кристаллизации, как описано ранее.

Критерии чистоты гуанидингидрохлорида хорошо известны: 1) спектр поглощения света 6 М раствора характеризуется по­ степенным увеличением поглощения с отсутствием пика в интер­ вале от 350 до 230 нм, после чего происходит резкое увеличение оптической плотности до 0,15 оптических единиц при длине вол­ ны 225 нм; 2) незначительные количества стандартных растворов кислоты или щелочи вызывают большой сдвиг pH раствора гуа­ нидингидрохлорида.

10.2.8.Равновесие ассоциации — диссоциации

При физиологических условиях белковые молекулы ведут себя обычно как монодисперсные вещества с определенным мо­ лекулярным весом, хотя, как следует из предыдущих разделов, большинство белков состоит более чем из одной полипептидной цепи. Однако в некоторых случаях между мономерами и поли­ мерами устанавливается равновесие, именуемое равновесием ас­

социации — диссоциации. При этом мономер может представлять собой одну полипептидную цепь (химотрипсин [157, 158], гемэритрин [159]) или субъединицу, состоящую более чем из одной полипептидной цепи (глутаматдегидрогеназа [9, 10]).

Предложено несколько механизмов равновесия ассоциации — диссоциации [2, 3, 5, 9]. Среди них имеется два предельных слу­ чая: а) замкнутое (одноступенчатое) равновесие ассоциации — диссоциации без образования промежуточных соединений [урав­ нение (10), в котором Mi — мономер] и б) открытое равновесие ассоциации — диссоциации с последовательным присоединением мономеров без ограничения, согласно уравнению (11), и с одина­ ковыми константами равновесия на каждом этапе.

В других случаях константы равновесия могут быть различными, т. е. одна константа характеризует димеризацию, вторая — все остальные этапы. Между этими предельными случаями возмож­ но большое число специальных случаев, например, после образо­ вания димеров из мономеров в дальнейшем ассоциируют только димеры.

Исследование равновесия ассоциации — диссоциации обычно проводят методами седиментационного равновесия и измерения светорассеяния, однако возможно также использование методов осмотического давления и хроматографии на молекулярных си­ тах. Способы интерпретации экспериментальных данных описаны рядом авторов [2, 3, 5, 6 и 160—164]. В .настоящее время путь выяснения истинного механизма ассоциации заключается в срав­ нении экспериментальных данных с кривыми, рассчитанными для различных модельных механизмов.

Примером замкнутого равновесия ассоциации — диссоциации может служить гемэритрин (в форме комплекса с азидом) из Golfingia gouldii. По данным седиментационного равновесия константа равновесия для ассоциации — диссоциации между мо­

Равновесие ассоциации — диссоциации для глутаматдегидрогеназы печени быка может быть описано как открытое

|Il |JLl||Ajl1|jLi|]ju |

аномальное седиментационное поведение. Пик градиента кон­ центрации не симметричен (на рис. 15, а и б даны кривые для растворов белка с низкой концентрацией), на стороне пика, об­ ращенной к растворителю, имеется «хвост», отстающий при се­ диментации от максимума пика. При концентрациях белка ниже 5 мг/мл коэффициент седиментации снижается с уменьшением концентрации белка [166, 167]. Эти аномалии происходят благо­ даря диссоциации молекул фермента на субъединицы. Появле­ ние отстающего «хвоста» при седиментации обусловлено умень­ шением концентраций белка на переходе через границу между раствором и растворителем, соответствующим распределению концентрации в кювете ультрацентрифуги. Это способствует дальнейшей диссоциации в ходе центрифугирования. Рис. 15 свидетельствует о том, что диссоциация при седиментации мо­ жет быть исключена, если опыт проводится в границеобразую­ щей кювете, с наслоением на раствор глутаматдегидрогеназы не чистого буфера (растворителя), а раствора того же фермен­ та, но с более низкой концентрацией. В этом случае граница

образуется между растворами глутаматдегидрогеназы с раз­ ными концентрациями, и пик градиентной кривой будет симмет­ ричен. В верхней же части наслоенного раствора в процессе седиментации образуется граница между раствором и раствори­ телем (идентичная границе при обычном способе наслоения растворителя на раствор), и градиент концентрации в этой об­ ласти кюветы становится несимметричным.

На основании данных измерения диффузии, седиментации и вязкости был сделан вывод, что молекула глутаматдегидроге-

Рис. 18. Зависимость средневесового молекулярного веса глутаматдегидро­ геназы от концентрации белка [9].

уравнению (11) при Kit i+1 = I,l ■10а М- 1 , М, 310 000, А2= 8 • Ю- 9 [моль-л/г2] М ^ каж .).

Кривая U w (истин.) построена без учета второго внриального коэффициента.

назы в состоянии ассоциации имеет вытянутую форму, а диссо­ циация приводит к поперечному ее расщеплению [165, 167]. Это заключение подтверждено измерениями рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами [8] (ср. с работой [10]). Радиус инер­ ции поперечного сечения молекулы и масса на единицу длины молекулы не зависели от концентрации белка, а следовательно, от молекулярного веса (рис. 16). В полном согласии с этим было получено линейное соотношение между длиной частиц глутамат­ дегидрогеназы и их молекулярными весами (рис. 17).

Зависимость молекулярного веса от концентрации белка ис­ следовалась при измерениях светорассеяния [9, 10]. На рис. 18 показано, что молекулярные веса достигают максимума при кон­ центрации около 9 мг/мл. При дальнейшем увеличении концен­