книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

354 ГЛАВА 9

цианурфторидом [37]. Полосы поглощения тирозина, МИТ иДИТ

[39]. Найденные значения рК иодированных тирозинов в белках составляют 7,9 для МИТ и 6,0 для ДИТ в лизоциме [39], 7,9 для ДИТ в инсулине [40], 8,2 для МИТ и 7,5 для ДИТ в тироглобулине [41]. Иодирование рибонуклеазы А наиболее детально ис­ следовала группа Шераги [42—46]. На основании полученных данных было постулировано существование трех пар водородных связей: Туг 92 — Asp 38, Туг 25 — Asp 14 и Туг 97 — Asp 83.

9.3.1.5. Тетранитрометан (ТНМ)

Тетранитрометан, предложенный Херриотом [47] в качестве мягкого нитрующего агента, использовался Валле с сотр. [48— 50] для распознавания различных состояний остатков тирозина. Помимо тирозина, ТНМ взаимодействует с сульфгидрильными группами цистеина, но не вступает в реакцию с остатками дру­ гих аминокислот. При работе с ТНМ необходимо соблюдать осторожность, поскольку он является ядовитым и сильно взрыв­ чатым веществом. За ходом реакции можно следить по возра­ станию концентрации ионов водорода (на pH-метре). Степень нитрования можно определять спектрофотометрически или ана­ лизом аминокислотного состава.

Полоса поглощения 360 нм (е=2790 М-1 смм ) неионизованной формы N-ацетил-З-нитротирозина смещается в слабо кислой среде в область 427 нм (е = 4100 М-1 см-1), становясь при иони­ зации более интенсивной (рК —7,0); изобестическая точка на­ ходится при 381 нм (е = 2200 М-1 см-1). При обработке карбоксипептидазы 64-кратным молярным избытком ТНМ нитруются 6,7—7,1 из 19 остатков тирозина. Однако при 4-кратном моляр­ ном избытке нитрование идет лишь по одному остатку, при этом пептидазная активность снижается до 10%, а эстеразная воз­ растает до 170% [49]. При действии ТНМ в присутствии р-фенил- пропионата, ингибитора карбоксипептидазы, ферментативная активность не изменяется. На основании этого было сделано предположение об участии остатка тирозина в работе активного центра.

9.3.1.6.Ферментативное окисление

Для частичного окисления остатков тирозина в нативных белках использовали тирозиназу [51—54] и полифенолоксидазу [55]. Например, тирозиназа с более высокой скоростью окисляет один из четырех остатков, вероятно Туг В26, свободного от цинка

знавания остатков триптофана в белках [81, 82]. Реакцию прово­ дят при pH 2,0—7,5; в этих условиях помимо триптофана идет модификация остатков цистеина. В щелочной области pH моди­ фикация идет помимо указанных аминокислот и по остаткам ти­ розина. За ходом реакции следят по выделению НВг (на рНметре) [82]. Модифицированный белок очищают гель-фильтра­ цией, после чего степень превращения реакции определяют фото­ метрически при 410 нм (е = 18 000 М-1 см-1). При низкой степени модификации оценка осуществляется более простым способом — по соотношению величин поглощения при 280 нм и 410 нм. Моди­ фикация 8 остатков триптофана в а-химотрипсине идет в различ­ ной степени в зависимости от pH [82]: п = 7,5 при pH 2,0;

п = 0,7— 1,3 при pH 3,5 — 5,6; п = 2,1 при pH 3,0. Бьюли и Ли

[81]применяли реагент Кошланда при исследовании лизоцима.

9.3.2.4.Прочие реагенты на триптофан

Триптофан является довольно лабильной аминокислотой, по­ этому для его частичной модификации используется ряд других методов: окисление озоном [83], фотоокисление [84, 85], иоди­ рование [86], модификация 2-нитрофенилсульфенилхлоридом (НФС-С1) и 2,4-динитрофенилсульфенилхлоридом (ДНСФ-С1) [87].

9.3.3.Гистидин

9.3.3.1.Диазобензолсульфбкислота

Этот реагент применяется для модификации остатков гисти­ дина и тирозина [88]; образующиеся при этом окрашенные ди­ азосоединения обладают сильным поглощением при 480 нм. Ци­ тохром с инактивируется при действии этого реагента [89].

9.3.3.2.Соли 1 Н-тетразолдиазония (ТД)

ТД модифицирует остатки гистидина и тирозина в белках с образованием моно- и б«с-азопроизводных, характеризующихся разными полосами поглощения [90, 91] (рис. 4.) £ыс-азотирозин (бис-Туг) обладает полосой поглощения в районе 550 нм, тогда как бис-азогистидин (бис-His) поглощает при 480 нм. Остаток моноазотирозина (моно-Tyr) имеет при pH 10,0 максимум погло­ щения при 480 нм; моно-Туг при pH 8,0 и моно-His при pH 8,0 и 10,0 характеризуются лишь конечным поглощением в видимой области. Полосы поглощения производных свободных аминокис­ лот, тирозина и гистидина [90] и остатков, входящих в состав

360 ГЛАВА 9

гистидина в активном центре химотрипсина [94], рибонуклеазы А [95] и цитохрома с [96]. Вайль с сотр. [97] исследовал влияние pH на степень фотоокисления лизоцима в аппарате Варбурга.

образом, окисление не идет специфично по гистидину, но на ран­ ней стадии реакции этот метод вполне может использоваться для исследования гистидина.

9.3.4.Специфическая модификация по аминогруппам

Для модификации аминогрупп лизина или N-концевых ами­ нокислот пептидов известно множество реагентов. Однако мно­ гие из них обладают слишком высокой реакционной способно­ стью и не могут применяться для распознавания состояния остатков аминокислот. В этом разделе рассматриваются лишь реагенты, обладающие умеренной реакционной способностью.

9.3.4.1.Нафтохинонсульфокислота (НХС)

инафтохинондисульфокислота (НХДС)

(З-Нафтохинон-4-сульфокислота, применявшаяся Фолиным [98, 99] для анализа аминокислот в моче и крови, обладает уме­ ренной реакционной способностью [100]. При реакции с амино­ группой желтая окраска, свойственная реагенту, очищенному по методу Фолина [98], переходит в желтовато-коричневую. В ходе реакции происходит арилирование аминогруппы с отщеплением сульфогруппы реагента. Определение проводят в несколько ста­ дий [100]: вначале инкубируют без доступа света реакционную смесь, включающую раствор белка, бикарбонатный буфер (pH 8,8), диоксан и раствор НХС в 50%-ном метаноле, а затем добавляют уксусную кислоту и диоксан. Далее определяют раз­ ницу в величине поглощения при 480 нм рабочего и контроль­ ного раствора, не содержащего белка; Дв48о = 3800 М-1см-1. При инкубации контрольный раствор приобретает интенсивную окраску, однако он почти полностью обесцвечивается при после­ дующем подкислении уксусной кислотой. Окраска, свойствен­ ная производным по аминогруппе, не исчезает при подкислении. Присутствие диоксана до и после подкисления предотвращает осаждение модифицированного белка. В табл. 3 сопоставлены результаты модификации аминогрупп ряда белков с помощью НХС и некоторых других реагентов.

Р-Нафтохинон-4,6 (или 4,7)-дисульфокислота (НХДС-4,6 или НХДС-4,7) модифицирует аминогруппы белков в той же сте-

Таблица 3

ЧИСЛО АМИНОГРУПП РАЗЛИЧНЫХ БЕЛ КОВ,-МОДИФИЦИРУЕМЫХ НХС (НХДС), ХФБ И ТНБС [100, 102, 1031

nt — общее число аминогрупп.

пени, как и НХС; модифицированные белки в этом случае бо­ лее устойчивы [101]. При модификации лизина НХДС-4,6 и НХДС-4,7 Дб48о составляет соответственно 7180 и 6500 М-1см-1. При расчете п используют V2 от этих величин. Нафтохинон-4,5- дисульфокислота не взаимодействует с аминогруппами белков.

9.3.4.2.Монохлортрифтор-п-бензохинон (ХФБ)

Монохлортрифтор-/г-бензохинон [102], порошкообразное ве­ щество желтого цвета, оно устойчиво в диоксане, но медленно гидролизуется в водных растворах. В дифференциальных спек­ трах продуктов реакции с аминокислотами имеется максимум при 350 нм (у глицина Дез5о=16 600 М-1 см-1, у лизина Дез5о= = 35200М-1 см-1). Дифференциальный спектр продуктов взаи­ модействия с белками имеет максимум при 353 нм, Дезбз в этом случае несколько выше. Для расчета п можно использовать Де353 = 21 600 М-1 см-1 бацитрацина, содержащего одну амино­ группу. ХФБ несколько менее реакционноспособен по сравне­ нию с НХС, НХДС и ТНБС (см. табл. 3) [100, 102, 103].

9.3.4.3.2,4,6-Тринитробензолсульфокислота (ТНБС)

Этот реагент, предложенный Окияма и Сатаке [104], также арилирует аминогруппы в*белках с отщеплением сульфогруппы. После инкубации при pH 9 в реакционную смесь добавляют '/з часть диоксана [103], а затем фотометрируют при 425 нм в срав­ нении с контрольным раствором. Диоксан тормозит постепенное

и практически бесконечное возрастание поглощения, обуслов­ ленное, по-видимому, сорбцией ТНБС на белке и (или) агрега­ цией модифицированного белка. Де определяют в тех же усло­ виях. Величины, полученные для аланина, взятого в качестве стандарта, варьируют в пределах 15 000—20 000 М-1 см-1.

При обработке трипсина НХДС, ХФБ и ТНБС модификация идет соответственно по 13, 4 и 14 аминогруппам (из 15), оста­ точная ферментативная активность составляет 50, 20 и 5% соот­ ветственно [103]. При аналогичной обработке а-химотрипсина (см. табл. 3) реакция идет по 13—14, 10 и 12 аминогруппам со­ ответственно, а остаточная активность составляет 60, 5 и 0%. Тономура [105, 106] определял аминокислотную последователь­ ность фрагментов G-актина, содержащих остатки лизина, моди­ фицированного ТНБС. Эти же авторы показали, что миозин присоединяет 2 моля ТНБС [107, 108], а также определили строение ТНФ-(тринитрофенил)-содержащих пептидов. По дан­ ным Такемори в цитохроме с модификация ТНБС идет по Lys72 и Lys 73 [109]. Модификация ТНБС одной или двух амино­ групп полностью инактивирует ингибиторы трипсина [ПО].

9.3.4.4.Метилизомочевина

При взаимодействии О-метилизомочевины или S-метилизо- тиомочевины с е-аминогруппой лизина образуется гуанидиновая группировка [111, 112]

эта реакция была использована Хаге с сотр. [113] для модифи­ кации О-метилизомочевиной сывороточного альбумина. Авторы

вращаются 54—55 из 68 аминогрупп. Затем этот реагент приме­ няли для модификации многих белков: казеина, гемоглобина, лизоцима и альбумина [114], химотрипсиногена [115, 116], рибонуклеазы [117, 118], пептидных гормонов [117], инсулина [119], цитохрома с [120] и ингибитора трипсина [121]. Реакция идет довольно избирательно, например, в инсулине удается полно­ стью перевести в гуанидиновое производное Lys В29, тогда как N-концевые GlyAl и PheBl модифицируются соответственно на V2 и 7ю [119]. Модификация 9 из ГО е-аминогрупп рибонуклеазы не инактивирует фермент, но модификация по крайней мере одной е-аминогруппы активного центра приводит к полному па­ дению активности [119]. S-Метилизотиомочевина менее реак-