книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков
..pdf
324 |
ГЛАВА 3 |
8.3.2.3. Разрезание геля
Для разрезания столбика геля в поперечном направлении предложены различные устройства [96—98]. Удобным прибором служит набор лезвий безопасной бритвы, фиксированных на двух стержнях с резьбой и отделенных друг от друга шайбами толщиной 1 мм.
8.3.2.4. |
Измерение pH |
pH определяют, анализируя экстракты отрезков геля; пря мые измерения производятся с помощью небольшого стеклян ного электрода, помещенного вместе с электродом сравнения на поверхность геля.
8.3.3.Методика
В основном эта методика соответствует обычной прописи для диск-электрофореза, детально описанной Дэвисом [99]. Однако подготовка для электрофокусирования осуществляется несколько проще и быстрее. Для достижения хорошего разрешения нет необходимости готовить несколько слоев геля и формировать плоскую поверхность столбика.
8.3.3.1.Состав геля
Ниже приводятся соотношения компонентов, необходимых для формирования геля в одной трубке (65X5 мм). Реактивы смешивают непосредственно перед употреблением в количестве, соответствующем числу трубок.
При полимеризации в присутствии катализатора
Вода |
0.8 |
мл |
Раствор акриламида (см. ниже) |
0,3 |
мл |
Амфолиты-носители (40%) |
0,03 мл |
|
Персульфат калия (10 мг/мл) |
0,07 мл |
|
свежеприготовленный |
30—300 мкг |
|
Образец белка |
||
Раствор акриламида |
|
|
N.N'-метилен-бис-акриламид |
1 г |
|
Акриламид |
30 г |
|
Вода |
до |
100 мл |
При фот.ополимеризации персульфат калия заме няют равным объемом раствора рибофлавина
(0,15 мг/мл)
Иногда бывает [78, 89, 91], что гели, содержащие амфолиты со средним pH выше 7, плохо полимеризуются при облучении; в этом случае рекомендуется снизить pH до 7, добавляя раз
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКА |
325 |
бавленную серную кислоту. (Образец здесь следует вносить вместе с исходным раствором, либо наслаивать со стороны ка тода.)
8.3.3.2.Полимеризация
Закрывают нижний конец трубки и заполняют ее указан ным выше раствором, не доходя 5 мм до края. Сверху тонко оттянутой пипеткой наносят слой воды толщиной 3 мм. При химической полимеризации гель застывает через 20—30 мин после приготовления рабочего раствора (20—25°С). Для фото полимеризации необходима экспозиция при сильном освещении в течение 30 мин. В том и в другом случае скорость полимери зации можно снизить, охлаждая рабочий раствор. Перед запол нением трубок рабочий раствор нужно дегазировать, для этого его выдерживают в вакууме при осторожном встряхивании. Эта мера позволяет избежать появления пузырьков в геле во время электрофокусирования.
8.3.3.3.Внесение образца
Образец можно вносить при формировании геля или же на слаивать сверху, как в обычном диск-электрофорезе. В первом случае при подготовке рабочего раствора необходимо ввести поправку на объем образца и несколько уменьшить количество воды. Наслаивание образца производится после сборки всего прибора или даже после создания градиента pH предваритель ным электролизом. Для этого верхнюю часть трубок заполняют 1%-ным раствором амфолитов-носителей в 5%-ной сахарозе. В электродные камеры осторожно заливают электролиты, а за тем с помощью микрошприца или тонко оттянутой пипетки на слаивают образец (в 10%-ном растворе сахарозы) на поверх ность геля.
8.3.3.4. |
Электрофорез |
|
Закрепляют трубки в приборе. Заполняют |
анодную камеру |
|
(обычно верхнюю) 0,2%-ной серной (или фосфорной) кислотой, |
||
а катодную — 0,4%-ным этаноламином (или |
этилендиамином);. |
|
Включают источник питания (сила тока до 2 мА на трубку). По мере падения электропроводности можно постепенно увеличи вать напряжение вплоть до 400 В, поддерживая постоянную силу тока. Через 1—3 ч отключают источник питания и удаляют гель из трубок, подавая воду между стенкой трубки и гелем с домощью инъекционной иглы.
326 |
ГЛАВА 8 |
8.3.3.5. Определение градиента pH
Столбик геля разрезают на 10—20 равных частей. Заливают каждую часть 1—2 мл воды и через несколько часов измеряют pH экстрактов.
8.3.3.6. Фиксация белков в геле
Зоны белка фиксируют путем погружения геля в 5%-иый рас твор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для многих белков этого вполне достаточно, так как вскоре зоны проявляются в виде бе лых полос. Однако если необходимо окрасить белок, вначале следует удалить амфолиты-носители, поскольку они дают ин тенсивную окраску с большинством красителей для белка.
8.3.3.7.Удаление амфолитов-носителей
Амфолиты отмывают осторожным перемешиванием (в тече ние 1—2 ч) в пяти последовательных порциях 5% ТХУ (10 мл на столбик геля). Более эффективное удаление амфолитов до стигается электрофорезом в 2,5% ТХУ в продольном или попе речном направлениях. Для электрофореза в продольном направ лении гель помещают в трубки большего диаметра, но сужен ные книзу. Затем в течение 20 ч пропускают электрический ток (10 мА на трубку). В кислой среде все амфолиты заряжены положительно и мигрируют к катоду (в нижнюю камеру). Более эффективным является электрофорез в поперечном направлении при высокой силе тока (70 мА на трубку). Это достигается на приборах, описанных Швабе [101] и Прусиком [102], аналогич ные приборы поставляются различными фирмами [80, 92]. При работе с хорошо фиксируемыми белками амфолиты можно от мывать 7%-ной уксусной кислотой [80] или смесью уксусная кислота — этанол — вода (1:5:4) [78]. Однако предварительно следует убедиться, что белки не вымываются вместе с амфо литами.
8.3.3.8. Окрашивание белков
После удаления амфолитов гели окрашивают в течение 1 ч 1%-ным раствором амидо-черного в 7%-ной уксусной кислоте, а затем обесцвечивают электрофорезом или промывкой в 7%-ной уксусной кислоте. Окрашивание в присутствии амфолитов-носи телей достигается [78] с помощью глубокого зеленого (Fast Green FCF) или светлого зеленого (Light Green SF). Однако в этом случае интенсивность окраски составляет 1/20 от интен сивности окраски комплекса с амидо-черным. Предварительное
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКА |
327 |
удаление амфолитов является не столь обязательным при про
явлении |
0 ,0 5 % -н ы м раствором кумаси |
синего [78, 79, 87, 103] |
(в 10% |
ТХУ). Однако при проявлении |
кумаси интенсивность |
окраски составляет 1/5 от интенсивности комплекса с амидо черным.
8.3.3.9.Регистрация полученных электрофореграмм
После фиксации в ТХУ гели фотографируют на черном фоне
сбоковым освещением. Окрашенные гели необходимо снимать
впроходящем свете. Предложенный недавно метод [104] съемки
вУФ-свете может найти применение для регистрации электро фореграмм в присутствии амфолитов. Если гели сканируют на
денситометре при 280 нм [105], необходимо предварительно про вести контрольное измерение. При денситометрии окрашенных гелей в видимой области контрольное сканирование можно не делать.
8.3.4.Выбор условий эксперимента
Ряд вопросов постановки эксперимента при электрофокуси ровании в градиенте плотности, такие, как выбор температуры, концентрации и pH-диапазона амфолитов-носителей, сохраняют свое значение и при электрофокусировании в геле. Другие аспекты, свойственные только этому методу, требуют специаль ного разбора.
8.3.4.1.Внесение образца
Количество вносимого образца определяется числом компо нентов и чувствительностью методов обнаружения. Для образца, состоящего из 10 компонентов, в случае фиксации с помощью ТХУ или окрашивания достаточной нагрузкой является 100—^ 200 мкг. В отличие от растворов сахарозы гелевая среда допускает любые нагрузки. При работе с плохо растворимыми об разцами в гель можно добавить мочевину (см. рис. 10 и 14),
При внесении образца в геле можно создавать очень низкие концентрации белка (менее 0,003%). Иногда разрешение не сколько выше, если образец вносить наслаиванием, однако при этом необходимо предварительное концентрирование образца.
8.3.4.2.Полимеризация акриламида
Полимеризация в присутствии катализатора — более надеж ный метод по срарнению с фотополимеризацией, однако она со провождается рядом осложнений [106—109]. Правда, в больший-
328 ГЛАВА 8
стве указанных случаев этогс удалось избежать, получая гель фотополимеризацией в присутствии рибофлавина. С другой сто роны, остатки персульфата можно удалить электрофорезом пе ред внесением образца. При напряжении 25—50 В и pH 4 или 8 на геле 40-5 мм удаление персульфата происходит за 30 мин [ПО].
О появлении множества ложных зон при электрофокусирова нии гемоглобина в геле с персульфатом калия сообщает Ригли [4]. В этом случае появления артефактов не удается избежать даже предварительным электрофорезом в течение 80 мин. Этот факт говорит о том, что при наличии в геле персульфата предва рительный электролиз, возможно, является недостаточной мерой. Поэтому рекомендуется всякий раз, когда это возможно, полу чать гель фотополимеризацией.
8.3.4.3.Природа геля
Почти во всех работах по электрофокусированию в геле применяется полиакриламидный гель (табл. 2). Этот гель пред почитают другим средам, так как в области pH 3—10 он содер жит мало заряженных групп, а также обладает низким электро
эндоосмосом |
(1—2 см |
за |
16 |
ч при электрофокусировании |
||
в блоке [89]). Несмотря на |
медленное смещение градиента pH |
|||||
в направлении катода |
[87, |
92], |
этот |
гель достаточно |
устойчив |
|
в течение эксперимента. |
|
|
таким |
образом, чтобы |
гель не |
|
Величина |
пор выбирается |
|||||
слишком ограничивал фокусирование зон. При этом необходимо, с одной стороны, обеспечить достаточную прочность геля и, с другой стороны, свободную миграцию белков с молекулярным весом примерно до 100 000. Удовлетворительным в этом отно шении является 7,5%-ный гель. Для более крупных белков не обходимо применять менее концентрированный гель, в случае необходимости его укрепляют включением агарозы [111, 112]. Сама агароза оказалась удобной средой для электрофокусиро вания в геле, предшествующего иммунодиффузии [78, 84].
8.3.4.4.Электролиты и полярность электродов
В качестве электролитов применяются различные сочетания кислот и оснований. Как показано на рис. 10, во всех случаях по лучаются совершенно одинаковые результаты. Показано также, что смена полярности электродов дает незначительный эффект, если не упоминать простое обращение спектра разделения.
8.3.4.5.Время
По мере установления градиента pH сопротивление геля воз растает и, наконец, становится постоянным. В области pH 3—10
330 |
ГЛАВА В |
столбика геля, метод внесения образца, градиент напряжения, перепад между зарядами компонентов и их изоточками, раз меры молекул. Время разделения исследуемого образца лучше всего определять опытным путем.
Электрофокусирование образца, нанесенного в виде узкой зоны, осуществляется быстрее по сравнению с образцом, распре деленным по всему гелю (для овальбумина и гемоглобина это время составляет 20 мин и около 45 мин соответственно).
Рис. 11. |
Изменение |
градиента pH |
в геле |
по направлению от анода (слева) |
к катоду |
(справа) |
через 10 мин (/) |
и 30 |
мин (2) после начала фокусирова |
|
ния. Диапазон pH амфолитов 3—10 [92]. |
|||
На рис. 12 приведен пример постепенного фокусирования сложной смеси белков, нанесенной на столбик геля с предвари тельно фокусированными амфолитами с диапазоном pH 3—10. Электрофокусирование завершается примерно через 50 минут, но спектр разделения фактически остается неизменным при бо лее длительном электролизе. Для сравнения отметим, что фоку сирование того же образца в более узком диапазоне pH, напри мер 5—8, занимает 75 мин.
Важно, чтобы электрофокусирование было доведено до конца. Так, в примере, приведенном на рис. 11, если бы гель, как обыч но, фиксировали примерно через 30 мин, то были бы сделаны ошибочные выводы о гетерогенности образца. К тому же в этом случае было бы трудно получить воспроизводимые спектры. Ана логичное положение можно наблюдать в случае сывороточного альбумина [91]. Мономер фокусируется при pH 3—10 за 15— 20 мин, полимеры достигают (в 7,5%-ном геле) того же положе ния, что и мономер примерно за 40 мин. При фиксации такого геля через короткое время (менее 40 мин) обнаруживается явная гетерогенность (в смысле р!) смеси, обусловленная раз-
