книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

циониоепособна по сравнению с О-метилизомочевиной [114]. Маекава и Линер [122, 123] показали, что при обработке трип­ сина S-метилгликозилизотиомочевиной на холоду (0°С) при pH 8,8 в течение 3 дней модификация идет по трем остаткам лизина и гистидина.

9.3.4.5.Янтарный ангидрид

С помощью янтарного ангидрида в белки вводят (через ами­ ногруппы) сукцинильную группировку, вследствие чего молекула приобретает более отрицательный заряд. Сузуки с сотр. показал [124—126], что при такой обработке наблюдается активация бактериальной амилазы. Кроме того, для введения в така-ами­ лазу карбоксила и сульфгидрильных групп эти авторы исполь­ зовали S-ацетилмеркаптоянтарный ангидрид с последующей об­ работкой гидроксиламином.

9.3.4.6.Изоцианат и изотиоцианат

Для модификации свободных аминогрупп применяются фенилизоцианат и фенилизотиоцианат [127, 128]. В последнее время для этой цели предпочитают использовать флуоресцеинизотиоцианат (ФТЦ), что объясняется более легкой индентификацией модифицированной аминогруппы. По реакционноспособности с (ФТЦ) аминогруппы инсулина располагаются в следую­ щем порядке: Phe В1 > Gly А1 >> Lys В29 [129, 130], что находится в соответствии с данными по модификации НХС, НХДС и ХФБ.

9.3.4.7.Прочие реагенты

Для модификации аминогрупп могут применяться реагент Сэнджера [131—133], 1-фтор-2,4-динитробензол и другие алкили­ рующие агенты, например моноиодуксусная кислота, ее эфир и амид. Помимо аминогрупп, эти реагенты могут алкилировать остатки цистеина, метионина и гистидина. Однако в обычных условиях проведения реакции они обладают слишком высокой реакционной способностью и не могут применяться для частич­ ной модификации. Были сделаны попытки алкилировать рибонуклеазу бромуксусной кислотой в более мягких условиях [134— 136], при этом удалось ввести карбоксильную группировку пре­ имущественно по остаткам гистидина. Хлорангидриды и анги­ дриды кислот позволяют ацилировать аминогруппы, оксигруппы серина и тирозина, модифицировать карбоксильные группы. Однако обычно они обладают слишком высокой реакционной способностью. Имеются сведения о том [136, 137], что при

Эта реакция была использована для частичной модификации карбоксильных групп в белках [46, 146, 147]. Хоар и Кошланд [146] использовали 1-бензил-3[3-диметиламино-(Ы)-пропил]-кар- бодиимид в виде n-толуолсульфоната, Хориниши с сотр. [147] применяли 1-этил-3[3-морфолино-(4)-пропил]-карбодиимид ЭМПК. В качестве аминного компонента обе группы исследователей использовали метиловый эфир глицина. Степень модификации определяют потенциометрическим титрованием или аминокислот­ ным анализом. При модификации лизоцима в присутствии ука­ занных реагентов конденсация идет соответственно по 8 и 6 карб­ оксильным группам (из 11). В присутствии реагента, предложен­ ного Хориниши, модификация идет по 1 из 2 карбоксилов бацитрацина и по 3 и 6 карбоксилов инсулина.

9.3.6.2.Диазосоединения

Обработка карбоновых кислот диазосоединениями является обычным методом получения сложных эфиров. При действии диазометана [148] в 85%-ном этаноле происходит частичное ме­ тилирование карбоксилов р-лактоглобина, а диазоацетамид и метилдиазоацетат [149] этерифицируют карбоксилы сывороточ­ ного альбумина человека. Недавно для этих целей стали исполь­ зовать диазоацетоглицинамид [150—152]. В этом случае при кислотном гидролизе образующегося сложного эфира получают свободный глицин, по избытку которого судят о степени моди­ фикации. В рибонуклеазе таким путем не удается модифициро­ вать Asp 14, Asp 38 и Asp 83, вероятно вследствие образования водородных связей с остатками тирозина.

9.3.7.Модификация цистеина

9.3.7.1.Препараты ртути

Из множества органических производных ртути наибольшее применение для модификации сульфгидрильный групп в белках находит /i-хлормеркурбензойная кислота (ПХМБ) [153]. При взаимодействии с SH-группой сильная полоса поглощения ПХМБ при 230—240 нм смещается в длинноволновую область: Аб2бо == 7600 М-1 см-1. Фотометрическое титрование легче всего осуществляется при использовании окрашенных производных ртути, например, натриевой соли 4-(4-ацетоксимеркурфенилазо- 1)-1-аминонафталин-7-сульфокислоты (4-замещенной кислоты Клеве) [154] и 1-(4-хлормеркурфенилазо)-2-нафтола (меркуроранжа) [155—157]. Содержание сульфгидрильных групп в бел­ ках, модифицированных меркур-оранжем, определяют фотомет­ рически при 592 нм (е = 2- 104М-1 см-1).

9.3.7.2.N-Этилмалеинимнд (ЭМИ)

ЭМИ характеризуется слабой (е = 620 М-1 см-1) полосой поглощения при 300 нм, исчезающей при его взаимодействии с SH-группой. Степень превращения реакции оценивают с по­ мощью дифференциальной фотометрии реакционной смеси в сравнении с контрольным раствором, не содержащим ЭМИ. ЭМИ не столь реакционноспособен, как ПХМБ, и поэтому яв­ ляется более удобным реагентом для избирательной модифика­ ции. Секину [159—161] удалось провести замещение по одной SH-группе субъединицы миозина. Остальные SH-группы белка способны взаимодействовать с ПХМБ. Модифицированные SHгруппы локализуют с помощью меченого 14С, ЭМИ или произ­ водных, имеющих хромофорную группировку. При реакции SHгрупп с И-(4-диметиламино-3,5-динитрофенил)-малеинимидом (ДДФМ) развивается желтая окраска [162]. S-ДДФМ-цистеин характеризуется езэо = 4900 М-1 см-1 (в ледяной уксусной кис­ лоте). Ямашита с сотр. [163] использовал ДДФМ при исследо­ вании миозина А и АТФ-азы с целью определения аминокислот­ ной последовательности вблизи модифицированных остатков ци­ стеина. Предварительно восстановленный цистеином бромелайн был с успехом модифицирован ДДФМ [164, 165]. С целью полу­ чения окрашенных производных малеинимида предприняты по­ пытки заменить этильную группу ЭМИ на другие группировки.

9.3.7.3Реактив Эллмана

Эллман [166] применял бис-(З-карбокси-4-нитрофенил) -ди­ сульфид для анализа SH-групп в тканях. При взаимодействии этого реагента с SH-группами белков дисульфидиый мостик восстанавливается; образующийся тиол характеризуется силь­ ной полосой поглощения при 412 нм.

9.3.7.4. Прочие реагенты

В качестве реагентов, алкилирующих SH-группы, исполь­ зуется моноиодуксусная кислота и ее амид. Степень модифика­ ции определяют аминокислотным анализом, по содержанию S-карбоксиметилцистеина, по количеству образовавшейся HI (На pH-метре) или по включению радиоактивной 14С метки. Вообще из-за высокой реакционной способности подобные алкилгалогениды непригодны в качестве реагентов для избира­ тельной модификации по SH-группам.

9.4.МОДИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ФЕРМЕНТА

9.4.1.Модификация монофункциональным реагентом О—R по остаткам, обладающим повышенной реакционной способностью

Первым актом ферментативного катализа является связы­ вание субстрата с остатком аминокислоты в каталитическом участке с образованием фермент-субстратного комплекса. Сле­ довательно, боковая цепь этой аминокислоты обладает повы­ шенной реакционной способностью в отношении образования такого комплекса. Так, в эстеразах, фосфорилазах и некоторых протеолитических ферментах избирательно ацилируется или фосфорилируется определенный остаток серина. Такая повы­ шенная реакционная способность остатка серина может исполь­ зоваться для его модификации. Однако комплекс с истинным субстратом неустойчив, он быстро распадается с образованием конечного продукта и свободного фермента. Идентификация аминокислотного остатка активного центра возможна лишь в том случае, если комплекс устойчив при последующем анализе. Для этих целей предпочтительно использовать плохие субст­ раты, или псевдосубстраты, образующие непродуктивный комп­ лекс, который будет распадаться до конечного продукта с низ­ кой скоростью.

Избирательное фосфорилирование специфического остатка серина в так называемых «сериновых протеиназах», таких, как химотрмпсин, трипсин и тромбин, впервые осуществлено Янсе­ ном с сотр. [167—169], применившим в качестве реагента диизопропилфторфосфат (ДФФ). Воздействие на эти ферменты моче­ вины [170—171] или фотоокисление (в присутствии метиленового синего) остатка гистидина активного центра, близкого остатку серина [85, 95], приводит к тому, что такие белки уже не удается модифицировать с помощью ДФФ. ДФФ не инактивирует бромелайн, папаин или така-амилазу А [172], поскольку эти фер­ менты не принадлежат к группе сериновых протеиназ; вместо остатка серина они имеют в активном центре остаток цистеина. С помощью ДФФ в них можно фосфорилировать некоторые остатки тирозина, но не SH-группу активного центра [56, 173]. Напротив, д-нитрофенилацетат (НФА) ацетилирует SH-rpynny глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и тем самым инактиви­ рует этот фермент [174, 175].

Специфический остаток серина в сериновых протеиназах можно фосфорилировать или алкилировать с помощью дру­ гих аналогичных реагентов: тетраэтилпирофосфата (ТЭПФ), ди- этил-4-нитрофенилфосфата, изопропилметилфторфосфата, диме-

тиламидоэтоксифосфорилцианида, пинаколилоксиметилфторфосфата, метилфторфосфорилхолиниодида, этоксиметилфосфорилтиохолиниодида. Кроме того, остаток серина можно моди­ фицировать более простыми реагентами: метансульфофторидом (МСФ), бензилсульфофторидом (БСФ), л-нитрофенилсульфофто- ридом (НФСФ) [176, 177], н-хлормеркурфенилсульфофторидом (ХМФФ) [178], дифенилкарбанилхлоридом (ДФКХ) [179—181].

Как указано в последующем разделе, при инактивации химотрипсина последними четырьмя реагентами следует учитывать влияние ароматического кольца. Химотрипсин не удается инак­ тивировать с помощью ДФКХ в присутствии индола, являюще­ гося ингибитором этого фермента. Помимо химотрипсина, ДФХК инактивирует трипсин, но не реагирует с химотрипсиногеном, диэтилфосфорилхимотрипсином и пепсином. ДФК-химотрипсин и ДФК-трипсин вновь активируются при обработке гидроксиламином или изонитроацетоном. Белки приобретают желтую окраску при модификации 4-фенилазодифенилкарбанилхлори- дом или фторидом [182].

При подкислении реакционной смеси остаток серина в химотрипсине, ацетилированный я-нитрофенилацетатом (НФА), ста­ билизируется [183—185]. Таким путем было показано, что НФА и ДФФ модифицируют один и тот же остаток серина. При обра­ ботке химотрипсина я-нитрофенилдиазоацетатом образуется диазоацетилхимотрипсин [186, 187]. При облучении такой груп­ пировки УФ-светом с длиной волны 320 нм образуется реак­ ционноспособный карбен, после разложения которого водой полу­ чают О-карбоксиметилпроизводное серина. Комплекс, в котором серин активного центра фосфорилирован субстратом, довольно устойчив [188]. С помощью ^Р-меченого субстрата были иденти­ фицированы два остатка серина в активном центре фосфоглюкомутазы [189—191]. Стабильный фосфорилированный комплекс образует также фосфоглицеромутаза [192]. Шиффово основа­ ние, образующееся между е-аминогруппой лизина активного центра и карбонилом субстрата, стабилизуется при обработке NaBH4 с образованием устойчивого вторичного амина [193, 194]. Этот прием использовали при исследовании альдолазы, трансальдолазы и ацетоацетатдегидрогеназы [195—200]. В присутствии мочевины пиридоксальфосфат также образует с остатком лизина пиридоксалевых ферментов шиффово основание, которое затем стабилизуется при восстановлении натрийборгидридом. Известны также реагенты, способные модифицировать активированные

VI

а второй несет реакционноспособную группировку Q—R. В ка­ честве таких реагентов для инактивации трипсина были исполь­ зованы метилгуанидин (О—А) и моноиодацетамид (Q—R). И действительно, порознь эти соединения не являются ингиби­ торами фермента; при совместном применении наблюдается инактивация трипсина. Инагами показал, что в качестве О—А- группы не может выступать бутилгуанидин, следовательно, для проявления ингибиторной активности существенное значение имеют размеры О-группировки

9.4.3.Введение негативной метки

Если остаток определенной аминокислоты маскирован или каким-либо иным образом защищен от действия реагента, можно пометить все остальные остатки этого типа, т. е. ввести «негативную» метку. Коэн и Варинга [226] обрабатывали холин­ эстеразу с помощью ДФФ в присутствии бутирилхолина, маски­ рующего активный центр. Затем модифицированный белок об­ рабатывали меченым ДФФ (32Р) в отсутствие бутирилхолина. Аналогичный метод был применен Кошландом с сотр. [227] при исследовании антител: вначале антитела к я-азобензоларсенату иодировали в присутствии гаптена, а затем в модифицирован­ ный белок вводили 13Ч.

Аминокислотные остатки активного центра фермента маски­ руют молекулами ингибитора или субстрата. Результаты моди­ фикации в присутствии и в отсутствие этих лигандов дают ин­ формацию относительно строения активного центра. При низкой концентрации перекись водорода в диоксане окисляет 5 из 7