книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

А

J _____________ L

5 10

Концентрация НАД*, 10~2люль/л

Рис. 6.

температура 20° С. е рассчитывается на моль связывающих участков при четырех связы­ вающих участках в молекуле фермента (М 140 000).

кул НАД"*" с молекулой дегидрогеназы из мышц млекопитающих не приводило к измеиеаню поглощения [90].

Длина волны, нм

гольдегидрогеназой печени лошади. Спектр поглощения фермент-кофер- ментного комплекса приведен с учетом поглощения алкогольдегидрогеназы. В спектры флуоресценции введена поправка на влияние растворителя (без коррекции спектральной чувствительности прибора). Интенсивность флуорес­ ценции выражена в произвольных единицах [91].

Концентрация НАД-Н, мкмоль/л

10.2.6.2.Флуоресцентная спектрофотометрия [45,87,88,91—93]

Молекулы НАД-Н (а также НАДФ.-Н) флуоресцируют в от­ личие от НАД+ (и НАДФ+) при облучении светом с длиной вол­ ны 340 нм. При образовании комплексов с пиридиннуклеотидзависимыми дегидрогеназами максимум флуоресценции НАД-Н сдвигается в более коротковолновую область и в большинстве случаев возрастает в несколько раз (рис. 7). При связывании с НАД-Н или НАД+ флуоресценция фермента тушится.

Изменения интенсивности флуоресценции при связывании кофермента с ферментом используются в методе флуориметрического титрования для оценки числа участков на молекуле фер­ мента, связывающих кофермент (рис. 8).

Определение К е , r и числа связывающих участков графиче­ ской экстраполяцией (по данным рис. 8) справедливо только для величин Ке, н а д -н не превышающих 10_6 М. В противном слу­ чае необходимо учитывать, что при низких концентрациях кофермента только часть его связывается с ферментом, и, следователь­ но, начальный наклон кривой титрования следует исправлять на величину количества свободного кофермента.

Если флуориметрический метод применяется для исследова­ ния конкурентного связывания НАД+ и НАД-Н согласно уравне­ нию (2), то необходимо учитывать, что НАД+ в какой-то мере снижает наклон Е—НАД-Н/НАД-Н [95]:

Е -Н А Д -Н + НАД+ Е—НАД+ + НАД-Н (2)

10.2.6.3.Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм [96—98]

При связывании НАД-Н дисперсия оптического вращения алкогольдегидрогеназы становится аномальной благодаря появ­ лению одного, ярко выраженного отрицательного эффекта Кот­ тона [96]. Этот необычный в данном случае эффект происходит в результате образования оптически активного комплекса между ферментом и коферментом. Асимметрическое связывание хромо­ форной молекулы с молекулой нативного белка-фермента инду­ цирует появление оптически активной полосы поглощения хромо­ фора. Точка перегиба на графике, иллюстрирующем эффект Кот­ тона алкогольдегидрогеназы печени лошади при длине волны 327 нм, соответствует близко расположенному максимуму погло­ щения комплекса фермент — НАД-Н. Стехиометрия связывания НАД-Н или аналогов кофермента с алкогольдегидрогеназой пе­ чени может быть количественно оценена путем титрования с по­ мощью метода дисперсии оптического вращения, используя измеценце амплитуды эффекта Коттона после добавления НАД-Н

[99] . Изменение спектра кругового дихроизма было использовано для оценки числа участков связывания НАД+ на молекуле глице- ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы мышц кролика [50].

10.2.6.4.Электронный парамагнитный резонанс

Спин-меченые аналоги кофермента можно применять для изу­ чения взаимодействия фермент — кофермент. Максимум в спек­ тре электронного парамагнитного резонанса аналога аденозин- 5/-дифосфат-4(2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил) расширялся при его связывании с алкогольдегидрогеназой печени лошади [100] . При титровании фермента спин-меченым аналогом изме­ ряют снижение амплитуды в спектре электронного парамагнит­ ного резонанса.

10.2.6.5.Диализ

Равновесный диализ является обычным методом измерения связывания малых молекул (лигандов) с макромолекулами. В ходе диализа лиганд проходит через мембрану в отделение, содержащее макромолекулы, и его концентрация снижается за счет связывания с последними [87, 101, 102]. По уменьшению кон­ центрации лиганда (например, НАД) и по известной концентра­ ции макромолекул (например, фермента) можно рассчитать чи­ сло связывающих участков и константу диссоциации комплекса фермент — кофермент. Объемы «внутреннего» и «внешнего» от­ делений аппарата для диализа должны быть очень точно изве­ стны и проверены на удобной контрольной системе. Этот метод был использован, например, при исследовании связывания НАД+ с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой мышц кролика [90].

Недостаток метода равновесного диализа состоит в том, что диффузионное равновесие через мембрану устанавливается в те­ чение нескольких часов, хотя в большинстве случаев действитель­ ное химическое равновесие для реакции связывания достигается за доли секунды. Этот недостаток преодолевается использова­ нием быстрого способа определения скорости отщепления радио­ активного лиганда при диализе от равновесной системы [103] фермент —лиганд. В таком случае даже при работе с неустойчи­ выми веществами быстро получают точные результаты.

10.2.6.6.Методы ультрацентрифугирования

Количественный анализ процесса связывания фермент — ко­ фермент можно проводить с помощью препаративных и аналити­ ческих ультрацентрифуг [87, 104, 105, 107].

При использовании препаративной ультрацентрифуги различ­ ные смеси кофермента и фермента, а также сам кофермент в

качестве контрольного опыта помещают в пробирки ротора и центрифугируют при высоких скоростях вращения ротора столь­ ко времени, чтобы фермент полностью седиментировал на дно пробирки центрифуги. Затем осторожно удаляют супернатант и анализируют количество кофермента в нем. Эту процедуру про­ делывают для каждой из пробирок со смесью кофермента и фер­ мента и количество кофермента в супернатанте сравнивают с контролем, т. е. с величиной, получающейся из пробирки, со­ державшей только один кофермент. По этим данным рассчиты­ вают количество связанного кофермента, а по известным началь­ ным концентрациям фермента и кофермента — количество молей кофермента, связываемого с одним молем белка в смесях раз­ ного состава. Отсюда можно определить максимальное число связывающих участков и константу диссоциации комплекса кофермент — фермент (уравнение 3):

мер, НАД+) на один моль фермента Е\ п — максимальное число

максимального числа связывающих участков. Линейность этого графика свидетельствует о независимости действия связываю­ щих участков, откуда следует, что все связывающие участки од­ ной молекулы белка имеют одинаковые константы диссоциации. Этот метод был применен к исследованию связывания НАД е алкогольдегидрогеназой [106].

Взаимодействующие системы могут быть исследованы коли­ чественно также с помощью аналитической ультрацентрифуги, если за связыванием лиганда можно проследить с помощью абсорбционной оптической системы [105, 107]. На рис. 9 пред­ ставлены седиментационные диаграммы серии опытов с различ­ ными смесями НАД-Н (ДПИ-Н) лактатдегидрогеназы. Диа­ грамма, относящаяся к раствору НАД-Н (слева), показывает, что весь материал, поглощающий свет при длине волны 340 нм, мигрирует медленно, тогда как после добавления фермента часть или весь кофермент, в зависимости от концентрации фер­ мента, седиментирует с тем же коэффициентом седиментации, что и нативный фермент. Из распределения поглощения света в кювете ультрацентрифуги в процессе седиментации можно рассчитать концентрацию связанного и свободного кофермента; на основе этих данных рассчитывается среднее число связанных с ферментом молекул кофермента и по уравнению (3 )— число связывающих участков и константы диссоциации.

Рис. 10. Зависимость между эффектами о-фенантролина и 8-оксихинолин- 5-сульфоновой кислоты на активность, связывание цинка и структуру алкогольдегидрогеназы дрожжей [127].

о-фенантролнна или 20 мМ З-оксихинолнн-5-сульфоновой кислоты. Аликвотные части ана­

ствием комплексообразователей, имеет л®о ^ = 2 ,8 S и Af 35 000 [46]) откладывали по абс­

циссе, ферментативную активность после инкубации с о-фенантролнном (О) или 8-оксн- хинолнн-5-сульфоновой кислотой (в ) на одной ординате, а связывание цинка после инкубации с о-фенаптролином (Д) или с 8-окснхинолин-5-сульфоновой кислотой (А)— на другой ординате.

а-амилазы Bacillus subtilis, но не для проявления ферментатив­ ной активности (рис. 11) {11, 129].

В некоторых случаях аллостерические ферменты могут быть сделаны нечувствительными к регуляторам. Например, воздей­ ствие теплом или обработка соединениями ртути вызывала по­ терю аллостерической способности у аспартаттранскарбамилазы с параллельной диссоциацией на С- и R-полипептидные цепи. Однако полипептидные цепи сохраняли свои функциональные свойства, а именно каталитическую активность и сродство к ре­ гуляторному метаболиту и цитидинтрифосфату соответственно

[57, 130, 131].

Денатурация и диссоциация могут протекать также при крайних значениях pH. В кислой и щелочной среде альдолаза [52, 132], глутаматдегидрогеназа [133—135], каталаза [54] диссо­ циируют до субъединиц или полипептиддых цепей. Однако в

10.2.7.1.Определение молекулярного веса

Молекулярный вес продуктов диссоциации определяют как химическими (ср. разд. 10.2.3 и 10.2.4), так и физическими мето­ дами. Для установления молекулярного веса обычно используют методы ультрацентрифугирования (седиментация, диффузия, седиментационное равновесие [104, 105, ПО—115]), измерения светорассеяния [116—118] и осмотического давления [136]. Ха­ рактеристическая вязкость полимерных цепей в конформации статистического клубка связана простым соотношением с моле­ кулярным весом. Следовательно, он может быть найден по из­ мерению вязкости [137] (ср. разд. 10.2.7.5). Плотности и вязко­ сти различных водных растворов представлены в табл. 2. Раз­ мер полипептидных цепей при денатурации можно оценить по полипептидам-маркерам с известными молекулярными весами при электрофорезе в полиакриламидном геле (ср. разд. 10.2.7.4)

игель-фильтрации (ср. разд. 10.2.7.5).

Вслучае гетерогенности получают различные средние моле­ кулярные веса. По данным измерения осмотического давления рассчитывают среднечисловой молекулярный вес Мп (уравне­ ние (4)), по данным светорассеяния и седиментационного равно­

весия— средневесовой молекулярный вес M w (уравнение (5)) или и тот и другой вместе:

данной смеси в граммах, ЛД — молекулярный вес молекул i-типа. Как следует из этих уравнений, при наличии низкомолекулярных примесей величина среднечислового молекулярного веса иссле­ дуемой смеси, рассчитываемая по измерению осмотического дав­ ления, будет ошибочно занижаться, а при наличии высокомоле­ кулярных примесей будет ошибочно завышаться величина сред­ невесового молекулярного веса.

Комбинация коэффициентов седиментации и диффузии для расчета молекулярного веса по уравнению Сведберга не дает точного средневесового молекулярного веса, а_приводит к двой­ ному средневесовому молекулярному весу («МЩ|Щ»). Среднечис­ ловой и средневесовой молекулярные веса используются наи­ более часто. Средние молекулярные веса более высокого поряд­ ка используются реже; они имеют названия Z-средний (Ш%),