книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

сти [233, 234]. В последнее время свойства этих соединений обра­ зовывать поперечные связи в молекуле фермента или между фер­ ментом и синтетическим полимером стали использоваться для стабилизации ферментов и белков или их фиксации на нераство­ римом носителе [235—237]. В области химии белка большой инте­ рес представляет возможность с помощью подобных реагентов определять расстояние между двумя аминогруппами в нативном белке. Одним из первых реагентов, нашедших подобное примене­ ние, является 2,4-динитро-1,5-дифторбензол (НФБ) [238, 239].

F

N 02

При обработке белка здесь образуется 2,4-динитрофенилено- вый мостик между двумя свободными аминогруппами. Образова­ ние такого мостика между а-аминогруппой Gly А1 и е-амино- группой Lys В29 в инсулине свидетельствует о большой гибкости этих полипептидных цепей в растворе. В случае лизоцима [240] мостик замыкается между Lys 7 и Lys 41, пространственно сбли­ женных в третичной структуре [241]. Фэсолд синтезировал 2,2'-ди- карбокси-4,4'-азофенилдиизоцианат, который использовал при исследовании миоглобина кашалота [242—245]. Здесь были иден­ тифицированы 4 внутримолекулярных мостика: Lys 16—Lys 34, Lys 34—Lys 47, Lys 56—Lys 62, Lys 145—Lys 147.

Аналогичный реагент, гексаметилендиизоцианат, модифици­ рует в рибонуклеазе 2 моля лизина [246]. С помощью другого реагента /гщ'-дифтор-ж.ж'-динитродифенилсульфона (ФНФС) [247] модифицировали 20 остатков лизина и некоторые остатки тиро­ зина в бычьем сывороточном альбумине [247—250]. Херциг с сотр. [251] синтезировал водорастворимые бифункциональные реагенты, фенол-2,4-дисульфохлорид и а-нафтол-2,4-дисульфо- хлорид, и использовал их для образования мостиков между остатками лизина в лизоциме. При исследовании лизоцима ис­ пользовали также а.а'-дибромксилолсульфокислоту (БКС) [252], несущую радиоактивные метки 35S и 3Н; таким путем в лизоциме было обнаружено образование двух мостиков, Lys3—Lys 116 и Lys 96—Lys 97, что совпадает с результатами, полученными при модификации Lys 13, Lys 33 и Lys 116 фенол-2,4-дисульфохлори- дом [251]. При такой модификации аминогруппы уже не несут в нейтральной среде положительного заряда, вследствие чего тре­ тичная структура становится менее стабильной, подверженной конформационным изменениям. Учитывая это обстоятельство, Зингер с сотр. [138, 253] синтезировал дихлоргидрат диэтилма-

Вторая, «сигнальная», группировка служит для передачи инфор­ мации о своем непосредственном окружении. Эта информация может быть представлена в виде спектральных смещений, изме­ нения окраски, флуоресценции или же в виде сигналов ЭПР.

9.6.1.Спектральные смещения полос поглощения остатков ароматических аминокислот

Полосы поглощения в УФ-области остатков триптофана, ти­ розина и фенилаланина сами по себе могут дать информацию относительно их непосредственного окружения. В зависимости от окружения может наблюдаться смещение максимума полос по­ глощения или изменение интенсивности. Ветлауфер и сотр. [256], а также Донован [257] и сотр. исследовали влияние заряда вслед­ ствие ионизации карбоксила, протонирования аминогруппы или других факторов на УФ-спектры ароматических аминокислот. Бигелов с сотр. [258, 259] изучали влияние растворителей и со­ става раствора.

Остаток ароматической аминокислоты может быть доступен для растворителя и подвергаться воздействию среды, или он мо­ жет быть маскирован в глубине глобулы, т. е. окружен боковыми цепями других аминокислот. В зависимости от состава среды или природы соседних аминокислот в УФ-спектре могут наблюдаться те или иные изменения, которые измеряют с помощью дифферен­ циальной спектрофотометрии между нативным и денатурирован­ ным или гидролизованным белком или же снятием спектров в различных средах. Например, по данным Инада [10], в диффе­ ренциальном спектре остатков триптофана в пепсине максимум лежит в области 298 нм, а Аб = 365 Мг1 см-1, по данным Доно­ вана [257], Ае = 240 М-1 см-1. Если построить график поглоще­ ния растворов пепсина при 298 нм в зависимости от pH, то на кривой будут видны две стадии изменения состояния 6 остатков триптофана [10, 260, 261]: п = 2 с рК 4,0 и п = 4 с рК 7,2 (про­ дукт необратимой денатурации). Две стадии наблюдаются в из­ менении поглощения для 2 из 6 остатков триптофана в лизоциме:

п = 1 с рК 3,15 (Де = 375 Мг1 см-1) и п = 1 с рК 6,2 (As =

=438 М '1 см"1).

Если спектр остатков данного вида претерпевает изменение

при добавлении химического реагента или иного растворителя, то можно определить число доступных остатков [262]. Интерес­ ные наблюдения получены Хамагучи [263, 264] при добавлении к лизоциму таких денатурирующих агентов, как гуанидин, моче­ вина и хлористый литий. Например, при увеличении концентра­ ции гуанидина можно наблюдать три стадии в изменении погло­ щения: 1) спектральные изменения (за счет добавления гуаниди­ на) остатков триптофана (я = 3— 4), доступных и подвержен­ ных действию растворителя; 2) изменения поглощения остатков

триптофана, демаскированных вследствие денатурирующего дей­ ствия гуанидина; 3) спектральные изменения за счет воздействия гуанидина на все демаскированные остатки триптофана. Для по­ добного рода исследований используют также тепловую денату­ рацию [265]. Аналогичные спектральные изменения наблюдаются для двух остатков триптофана в химотрипсине после обработки фермента ДФФ [266—269] или при активации химотрипсиногена [270, 271]. Изменения в спектре поглощения тирозина с трудом поддаются анализу вследствие перекрывания с полосами трипто­ фана. Было показано, что в инсулине, не содержащем трипто­ фана, спектральные изменения наблюдаются для одного остатка тирозина (/г( = 4) при протеолизе белка, а для второго — при подкислении гидролизата [22—23].

9.6.2.«Репортерная» группа

При алкилировании белка 2-бромацетамидо-4-нитрофенолом или 4-бромацетамидо-З-нитрофенолом получают окрашенное в желтый цвет производное с так называемой «репортерной» груп­ пой, спектр которой зависит от ее непосредственного окружения [272, 273]. В случае триозофосфатдегидрогеназы — белка, со­ стоящего из 4 субъединиц, каждая из которых имеет НАД-свя- зывающий участок и активную SH-rpynny — 1 моль фермента связывает 3,7 моля 2-бромацетамидо-4-нитрофенола. В районе pH 7,0—7,6 е соответствующей группировки в белке составляет 7100 М-1 см-1 (при Ящах = 390 нм). Алкилирование ведет к по­ тере 3,8 моля SH-групп и полной инактивации фермента.

Если из раствора модифицированного белка сорбцией на угле удалить НАД, а затем прибавить вновь, то полоса поглощения репортерной группы (390 нм) смещается в длинноволновую об­ ласть. В дифференциальном спектре при таком смещении обна­ руживается максимум при 420 нм и минимум при 370 нм. Алки­ лирование дегидрогеназы 4-бромацетамидо-З-нитрофенолом протекает примерно с таким же выходом (4,1 моля), а полоса репортерной группы 426 нм смещается в область 436 нм (при 435 нм и pH 6,9 е = 3000 М-1 см-1) [274]. Однако при добавлении НАД эта полоса смещается в коротковолновую область спектра. Эти же реагенты способны алкилировать остаток метионина в химотрипсине; при добавлении бензоилфенилаланина к модифи­ цированному ферменту полосы этих двух группировок также смещаются в противоположных направлениях. Репортерная группа ТНМ обладает аналогичными свойствами [49].

9.6.3.Метод спиновой метки

Реагенты для введения спиновой метки, впервые предложен­ ные Ониши и МакКоннелом [275], содержат радикалы, спектр ЭПР которых чувствителен к окружению метки. В области химии

белка нашли применение хлорпромазин и N-окиси; особенно ши­ рокое применение нашли более стабильные N-окиси типа

Н R

где R означает реакционноспособную группировку. В сочетании с Si и S2 использовали несколько реакционноспособных группи­ ровок, предназначенных для модификации боковых цепей раз­ личных аминокислот.

Реагент Si—Re применяли для модификации бычьего сывороточ­ ного альбумина. По данным спектроскопии ЭПР радикалы Si, фиксированные на белке, находятся в двух различных состоя-, ниях: в состоянии свободного вращения и в неподвижном или заторможенном состоянии. Более устойчивый реагент Si—R& ис­ пользовали для модификации 15 различных белков и ферментов. Показано, что в креатинкиназе и гемоглобине радикал Si, фикси­ рованный при SH-группе, находится в неподвижном состоянии. Радикалы, фиксированные на других белках и на полилизине, находятся в состоянии свободного вращения. При исследовании гемоглобина использовали реагенты Si—Rj,, Si—Rc, Sr—Rd и

378 ГЛАВА 9

S2—Rb [278—280, 282]. Спектр ЭПР меченого оксигемоглобина представлял собой наложение широких и узких полос, вызванных радикалами, фиксированными в (3-субъединице при SH-rpynne Cys93 и по остаткам лизина. При сравнении этого спектра со спектром дезоксигемоглобина обнаруживается некоторая затор­ моженность радикалов первого типа, вызванная оксигенированием. При образовании тетрамера агРг после смешения меченой р-субъединицы с а-субъединицей спектр ЭПР претерпевает оп­ ределенные изменения.

Иные задачи решались при исследовании взаимодействия ре­ агента Si—Re с химотрипсином [281]. Этот реагент типа А—О—S сорбируется на участке связывания химотрипсина через арома­ тическую группу Re; спектр ЭПР свидетельствует о полной затор­ моженности радикала Si.

9.6.4.Связывание флуоресцентных меток

сгидрофобными участками белковой глобулы

Присутствие гидрофобных областей в структуре белков дока­ зано экспериментально по данным растворимости углеводородов в растворах белков [283—286] и по интенсификации флуоресцен­ ции реагентов типа R—О—S или А—О—S, связанных или сорби­ рованных в этих областях. На большое значение флуоресценции при таких исследованиях впервые указывали Остер и Нишиджима [287, 288]. Они подчеркивали, что молекула основания со свободно вращающейся группой хромофора начинает сильно флуоресцировать, если вращение заторможено вследствие ад­ сорбции. Тушение флуоресценции вследствие теплого рассеяния энергии возбуждения за счет внутреннего вращения может быть уменьшено при фиксации планарной молекулы на биополимере. В последнее время подобное увеличение флуоресценции иссле­ дуется в связи с наличием в белках гидрофобных областей. На­ пример, при адсорбции 1-анилино-8-нафталинсульфокислоты (АНС) на апомиоглобине и апогемоглобине, свободных от груп­ пы гема, флуоресценция группы претерпевает изменения; добав­ ление гема восстанавливает первоначальную флуоресценцию [289]. При адсорбции полоса флуоресценции 515 нм смещается в область 454 нм, а квантовый выход увеличивается в 200 раз, от 0,004 до 0,98. Вообще я я возбужденные состояния я-электрон- ной системы стабилизуются по сравнению с основным состоянием за счет воздействия молекул растворителя в относительно боль­ шей степени, так что снятие этого эффекта интенсифицирует флуоресценцию и вызывает смещение в длинноволновую часть спектра. Опыты с модельными соединениями в растворителях с различными дипольными моментами свидетельствуют в пользу такого объяснения. Доказательством наличия в бычьем сыворо­

точном альбумине гидрофобных областей служат результаты его взаимодействия с АНС. МакКлар и Эдельман [290] показали, что при взаимодействии 2-п-толуидинилнафталин-б-сульфокислоты (ТНС) с бычьим сывороточным альбумином и (3-лактоглобули- ном наблюдается усиление флуоресценции. Деранло и Нейрат [291] использовали «дансил»-производные этиловых эфиров амино­ кислот.

н 3Сч / СН3

N

S02NHCHC00C2H6

I

R

Варьируя аминокислоты, эти авторы получили набор соеди­ нений, обладающих различной специфичностью. Присутствие участков связывания в химотрипсиногене и химотрипсине было доказано при взаимодействии с соответствующим производным триптофана. Для подобных исследований использовали также производные кумарина [293] и стильбена с гидрофобными боко­ выми цепями [292], например натриевую соль 4,4-быс-[2-хлор-4- диэтаноламино - 1,3,5-триазил (6)]-диаминостильбен-2,2-дисульфо­ кислоты. По-видимому, наилучшими свойствами обладают все же производные кумарина. Например, 4-метил-7-диэтиламиноку- марин (МДК) не содержит заряженных группировок, растворим во многих растворителях, может взаимодействовать с белками

вводных растворах в широком диапазоне pH выше 5. С по­ мощью МДК было установлено присутствие участков связывания

винсулине, бычьем (3-лактоглобулине и бычьем сывороточном альбумине. В последнее время Секин с сотр. [294, 295] использо­ вал в. работе флуоресцентные производные N-этилмалеинимида, относящиеся к типу R—О—S.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Inada У., J. Biochem. (Tokyo), 49, 217 (1961).

2.Hermans J., Jr., Biochemistry, 2, 193 (1962).

3.Hermans J., Jr., Biochemistry, 2, 453 (1962).

4.Tachibana A., Murachi T., Biochemistry, 5, 2756 (1966).

5.Crammer J. L., Neuberger A., Biochem. Jr, 37, 302 (1943).

6.Inada У., Kamata M„ Matsushima 4., Shibata /(., Biochim. Biophys. Acta, 81, 323 (1964).

7.Matsushima <4., Inada Y., Shibata K., Biochim. Biophys. Acta, 121, 338 (1966).

538(1966).

9.Tanford C., Hauenstein J. D., Rands D. G., J. Am. Chem. Soc., 77, 6409 (1956).

10.lnada У., Matsushima A., Kamata M., Shibata K., Arch. Biochem. Bioohvs 106, 326 (1964).

11. Smillie L. B., Kay C. M„ J. Biol. Chem., 236, 112 (1961).

12. Simpson R. T., Riordan J. F., Vallee B. L., Biochemistry, 2, 616 (1963).

13.Simpson R. T., Vallee B. L., Federation Proc., 22, 493 (1963).

14.Hamaguchi K., Ikeda K., Sakai H., Sugeno K., Narita K., J. Biochem (To­ kyo), 62, 99 (1967).

15.Stellwagen E., Biochemistry, 3, 919 (1964).

16. Rupley J. A., Biochemistry, 3, 1648 (1964).

' 17. Nagel R. L., Ranney H. M., Kucinkis L. K-, Biochemistry, 5, 1934 (1966).

22. Laskowski M., Jr., Widom J. M., McFadden M. L., Scheraga H. A., Bio­ chim. Biophys. Acta, 19, 581 (1956).

23. Laskowski M., Jr., Leach S. J., Scheraga H. A., J. Am. Chem. Soc., 82,

571 (I960).

24.Laskowski M., Jr., Leach S. J., Scheraga H. A., J. A., Chem. Soc., 82, 2154 (I960).

25.Leach S. J., Scheraga H. A., J. Am. Chem. Soc., 82, 4790 (1960)

26.Herskovits T. T„ J. Biol. Chem., 240, 628 (1965).

27.Riordan J. F., Wacker W. E. C., Vallee B. L„ Nature, 208, 1209 (1965)

28.Riordan J. F., Wacker W. E. C., Vallee B. L, Biochemistry, 4, 1758 (1965).

29.Ulmer D. D., Biochemistry, 5, 1886 (1966).

30.Hachimori Y., Matsushima A., Suzuki M., Inada Y., Shibata K. Biochim Biophys. Acta, 124, 395 (1966).

31.De Zoeten L. W., De Bruin O. A., Rec. Trav. Chirn., 80, 907 (1961)

32.De Zoeten L. IF., Havinga £., Rec. Trav. Chim., 80, 917 (1961).

33.Springell P. H., Biochim. Biophys. Acta, 63, 136 (1962).

34.Springell P. H., Biochem. J., 83, 7P (1962).

35.Hashizume H., Jmahori K-, J. Biochem. (Tokyo), 58, 60 (1965).

36.Hughes W. L., Jr., Straessle R., J. Am. Chem. Soc., 72, 452 (1950).

37.Hachimori Y. K-, Kurihara K., Horinishi H., Matsushima A., Shibata К

Biochim. Biophys. Acta, 105, 167 (1965).

38.Woody R. IF., Friedman M. E., Scheraga H. A., Biochemistry, 5, 2034

39.Wolff J., Covelli I., Biochemistry, 5, 867 (1966).

40.Gruen L., Laskowski M., Scheraga H. A., J. Biol. Chem., 234, 2050 (1959)

41.Edelhoch H„ J. Biol., Chem., 237, 2778 (1962).

42.Cha C.-Y., Scheraga H. A., J. Biol. Chem., 238, 2958, 2965 (1963).

43.Fujioka H., Scheraga H. A., Biochemistry, 4, 2206 (1965).

44.Li L.-K-, Riehm J. P., Scheraga H. A., Biochemistry, 5, 2043 (1966).

45.Friedman M. E., Scheraga H. A., Goldberger R., Biochemistry, 5, 3770

46.Riehm J. P., Scheraga H. A., Biochemistry, 5, 99 (1966).

47.Herriott R. M., Advan. Protein Chem., 3, 170 (1947).

48.Riordan J. F., Sokolovsky M., Vallee B. L., J. Am. Chem. Soc., 88, 4104 (1966).

49.Riordan J. F., Sokolovsky M., Vallee B. L., Biochemistry, 6, 358 (1967).

50. Sokolovsky М., Riordan J. F., Vallee В. L., Biochemistry, 5, 3582 (1966).

51.Cory J. G., Frieden E., Biochemistry, 6, 116 (1967).

52.Cory J. G., Frieden E., Biochemistry, 6, 121 (1967).

53. Yasunobu К■ T., Dandliker W. B., J. Biol. Chem., 224, 1065 (1957).

54.Yasunobu К. T., Peterson E. W., Mason H. S., J. Biol. Chem., 234, 3291 (1959).

55.Lissitzky S., Rolland M., Lasry S., Biochim. Biophys. Acta, 39, 379 (1960).

56.Murachi T., Inagami T., Yasui M., Biochemistry, 4, 2815 (1965).

57.- Nakamura K-, Matsushima A., J. Biochem. (Tokyo), 65, 785 (1969).

58.Covelli /., Wolff J., Biochemistry, 5, 860 (1966).

59.Frieden E., Ottesen M., Biochim. Biophys. Acta, 34, 438 (1959).

60.Yasunobu К. T., Wilcox P. E., J. Biol. Chem., 223, 309 (1948).

61.Takenaka O., Horinshi H., Shibata K-, J. Biochem. (Tokyo), 62, 501 (1967).

62.Steiner R. F., Biochemistry, 5, 1964 (1966).

63. Dube S. К., Roholt O. A., Pressman D., J. Biol. Chem., 241, 4665 (1966).

64.Hass L. F., Lewis M. F., Biochemistry, 2, 1368 (1963).

65.Flatmark T., Acta Chem. Scand., 18, 1796 (1964).

66.Wishnia Л., Weber /., Warner R. C., J. Am. Chem. Soc., 83, 2071 (1961).

67. Herskovits T. 7\, Laskowski M., Jr., J. Biol. Chem., 237, 2481 (1962).

68.Patchornik A., Lawson W. B., Witkop B., J. Am. Chem. Soc., 80, 4747 (1958).

69.Patchornik A., Lawson W. B., Witkop B., J. Am. Chem. Soc., 80, 4748 (1958).

70.Schmir G. L., Cohen L. A., Witkop B., J. Am. Chem. Soc., 81, 2225 (1959).

71.Patchornik A., Lawson W. B., Gross E., Witkop B., J: Am. Chem. Soc., 82, 5923 (1960).

72.Ramachandran L. K-, Witkop B., J. Am. Chem. Soc., 81, 4028 (1959).

79.Koshland D. E., Jr., Karkhanis Y. D., Latham H. G., J. Am. Chem. Soc., 86, 1448 (1964).

80.Horton H. R., Koshland D. E., Jr., J. Am. Chem. Soc., 87, 1126 (1965).

81.Bewly T. A., Li С. H„ Nature, 206, 624 (1965)

82.Oza N. B., Martin C. J., Biochem. Biophys. Res. Commun., 26, 7 (1967).

83.Previero A., Coletti M. A., Galzigna L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 16, 195 (1964).

84.Weil L., Jones S., Buchert A. R., Arch. Biochem. Biophys., 46, 266 (1953).

85.Piras R., Vallee B. L., Biochemistry, 5, 849 (1966).

86.Ramachandran L. K-, Chem Rev., 56, 199 (1956).

87.Scoffone E., Fontana A., Rocchi R., Biochem. Biophys. Res. Commun., 25, 170 (1966).

88.Frankel-Conrat H., Methods in Enzymology, Vol. 4, Academic Press, New

York, 1957, p. 247.

90.Horinishi H., Hachimori У., Kurihara K-, Shibata K., Biochim. Biophys. Acta, 86, 477 (1964).

91.Takenaka A., Suzuki T., Takenaka O., Horinishi H., Shibata K., Biochim. Biophys. Acta, 194, 293 (1969).

92. Suzuki Т., Takenaka О., Shibata К., J. Biochem. (Tokyo), 66, 815 (1969).

93.Kasai H., Ando T., Seikagaku, 39, 570 ,1967).

94.Jandorf B. J., Michel H. 0., Schaffer N. K-, Egan R., Summerson 117. /•/., Discussions Faraday Soc., 20, 134 (1955).

95.Weil L., Seibles T. S., Arch. Biochem. Biophys., 54, 368 (1955).

96.Nakatani M„ J. Biochem. (Tokyo), 48, 633 (I960).

97.Weil L., Buchert A. R., Maher J., Arch. Biochem. Biophys., 40, 245 (1952).

98.Foliti 0., J. Biol. Chem., 51, 377 (1922).

99.Folin 0., J. Biol. Chem., 51, 393 (1922).

101.Matsushima A., Sakurai K., Nomoto Л4., Inada У., Shibata K., J. Biochem. (Tokyo), 64, 507 (1968).

102.Nakaya K-, Horinishi H., Shibata K., J. Bochem. (Tokyo), 61, 337 (1967).

103.Shibata K., Abstract, 7th Intern. Congr. Biochem. Tokyo, Col., 1—2 (1967).

104.Okuyama 7\, Satake K-, J. Biochem. (Tokyo), 47, 454 (1960).

105.Tonomura У., Tokura S., Sekiya K-, J. Biol. Chem., 237, 1074 (1962).

106.Tokura S., Tonomura У., J. Biochem. (Tokyo), 53, 422 (1963).

107.Kubo S., Tokura S., Tonomura У., J. Biol. Chem., 235, 2835 (1960).

108.Tokuyama A., Kubo S., Tonomura У., J. Biochem. (Tokyo), 60, 701 (1966).

109. Takemori S., Wada K-, Ando K-, Hosokawa M., Sekuzu /., Okunuki K.,

J.Biochem. (Tokyo), 52, 28 (1962).

110.Haynes R., Osuga D. 7\, Feeney R. E., Biochemistry, 6, 541 (1967).

111.Kanpfhammer J., Muller H., Z. Physiol. Chem., 225, 1 (1934).

112.Greenstein J. P., J. Biol. Chem., 109, 541 (1935).

113.Hughes W. L., Jr., Saroff H. A., Carney A. L, J. Am. Chem. Soc., 71, 2476 (1949).

114.Roche J., Mourgue M., Baret R., Bull. Soc. Chim. Biol., 36, 85 (1954).

115.Chervenka С. H., Wilcox P. E., J. Biol. Chem., 222, 621 (1956).

116.Chervenka С. H., Wilcox P. £., J. Biol. Chem,, 222, 635 (1956).

117. Geschwind I. /., Li С. H., Biochim. Biophys. Acta, 25, 171 (1957).

118.Klee W. A., Richards F. M., J. Biol. Chem., 229, 489 (1957).

119.Evans R. L., Saroff H. A., J. Biol. Chem., 228, 295 (1957).

120. Hettinger T. P., Harbury H. A., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S., 52, 1469 (1964).

121.Kassell B., Chow R. B., Biochemistry, 5, 3449 (1966).

122.Maekawa K., Liener I. E., Arch. Biochem. Biophys., 91, 101 (1960).

123.Maekawa K-, Liener I. E., Arch. Biochem. Biophys., 91, 108 (1960).

124.Suzuki S., Hachimori У., Nippon Kagaku Zasshi, 89, 614 (1968).

125.Suzuki S., Hachimori Y., Matoba R., Biochim. Biophys. Acta, 167, 641 (1968).

126.Suzuki S., private communication.

127.Anderson W., Acta Chem. Scand., 8, 1723 (1954).

128.Christensen H. N., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg, 28, 265 (1951).

129.Tietze F., Mortimore G. E., Lomax N. R., Biochim. Biophys. Acta, 59, 336 (1962).

130.Bromer W. W., Sheehan S. K-, Berns A. W„ Arquilla E. R., Biochemistry.

6, 2378 (1967).

131.Sanger F., Biochem. J., 39, 507 (1945).

132.Sanger F., Biochem. J., 40, 261 (1946).

133.Porter R. R., Sanger F., Biochem. J., 42, 287 (1948).

134.Bernard E. A., Stein W. D., J. Mol. Biol., 1, 339 (1959).

135.Stein W. D., Bernard E. A., J. Mol. Biol., 1, 350 (1959).

136.Vratsanos S. M., Arch. Biochem. Biophys., 90, 132 (1960).

137.Vratsanos S. M., Bier M., Nord F. F., Arch. Biochem. Biophys. 77, 216 (1958).

138.Wofsy L., Singer S. J., Biochemistry, 2, 104 (1963).