книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

рической оценки фотоснимка оказалось, что здесь разрешение намного выше, чем на реальном профиле элюирования. С целью повышения эффективности элюирования некоторые авторы гидрофобизуют стенки колонки различными реагентами [25, 26, 40]. Однако этот прием еще не стал общепринятым.

8.2.5.10.Анализ элюата

Существенным недостатком электрофокусирования в гради­ енте плотности является трудность детектирования амфолитовобразцов в присутствии амфолитов-носителей и сахарозы. Наи­ более удобным методом обнаружения служит определение фер­ ментативной активности. Правда, амфолиты-носители могут

связывать ионы металла, который может выступать в роли ко­ фактора. В таком случае в среду добавляют избыток соответ­ ствующей соли. Часто используют иммунологическое определе­ ние, в этом случае анализу не мешают ни амфолиты-носители, ни сахароза.

Определение белка по Лоури в данном случае неприменимо [41], поскольку амфолиты-носители дают сильную реакцию. Удовлетворительные результаты удается получить после диа­ лиза или осаждения белка трихлоруксусной кислотой.

В случае биуретовой реакции [42] ни амфолиты, ни сахароза не препятствуют анализу, однако метод непригоден из-за низ­ кой чувствительности (0,5—3 мг белка/мл). Возможно, более удачным окажется микровариант этого метода [43].

Флуоресценция при УФ-освещении является чувствительным методом обнаружения белков, в данном случае амфолиты не препятствуют определению.

Наиболее распространенным методом является определение оптической плотности при 280 нм. Этот метод обладает доста­ точной чувствительностью, позволяет вести анализ в потоке и не сопровождается потерей вещества. Однако сами амфолитыносители обладают сильным поглощением при 280 нм, и колеба­ ния в оптических свойствах отдельных соединений могут быть ошибочно приняты за зоны белка. Вследствие этого необходимо провести определение нулевой линии, свойственной данной пар­ тии амфолитов; подобный пример приведен на рис. 4. Отклоне­ ние от нулевой линии невелико как при биуретовой реакции,так и при записи поглощения при 280 нм. Фон при 254 нм доста­ точно велик. Поэтому обычные проточные денситометры, где анализ ведется при 254 нм (линия ртути), непригодны в случае электрофокусирования.

При электрофокусировании используют препараты сахарозы, обладающие низким поглощением в УФ-области. Некоторые ис­ следователи рекомендуют применять сахарозу фирмы «Mallinckrodt». Удовлетворительные результаты получены и с другими препаратами. Ирлэнд и Рамсден [44] отмечали, что при электрофокусировании в некоторых образцах сахарозы обнаруживаются примеси, подобные белку. В этом случае может оказаться по­ лезным определение нулевой линии препарата.

В конечном счете наиболее удобным методом детектирования белков является определение оптической плотности при 280 нм. Фракции, представляющие интерес, могут быть затем подверг­ нуты анализу после удаления сахарозы и амфолитов-носителей с помощью диализа.

8.2.6.Результаты и пути применения

Электрофокусирование окрашенных белков, скажем натив­ ного гемоглобина, является прекрасной демонстрацией процес­ сов, происходящих в колонке, а также служит хорошим упраж­ нением при обучении работе на приборе. Зоны, полученные при делении гемоглобина, приведены на рис. 5. Профиль элюирова­ ния, записанный при 254 нм, приведен на рис. 6. Градиент pH здесь в целом линейный; pH в пробирках с максимальной кон­ центрацией компонентов соответствует их изоточкам.

Белки, подвергавшиеся электрофокусированию в градиенте плотности, перечислены в табл. 1. По-видимому, благодаря легкому детектированию наиболее подробно изучены окрашен­ ные белки, включая металлопорфирины. Как уже отмечалось,

вается примерно через 10 ч (конечное напряжение составляет 500 В). Рабочий раствор сливают через тонкий шланг, присое­ диненный в верхней части правого рабочего плеча. Слив осуще­ ствляют путем подачи 40% раствора сахарозы в левое плечо. U-образиая трубка термостатироваиа с помощью водяной бани.

Веллер рекомендует использовать U-образную трубку боль­ шей емкости, объемом 33 мл. По-видимому, для термостатирования колонки еще больших размеров наружной водяной бани уже недостаточно. Представляется целесообразным использовать эту систему для подбора условий или для аналитических экспе­ риментов. Однако если не перейти к микрометодам и собирать фракции обычных объемов, то их количество окажется явно не­ достаточным для точных исследований.

Вальме [4,126] приводит описание прибора, пригодного скорее для «зонного конвекционного электрофокусирования» в обычном электролите. Фракционирование в данном случае происходит в горизонтальном направлении между двумя охлаждаемыми платами, верхняя и нижняя поверхности которых сделаны рифле­ ными для предотвращения перемешивания.

8.2.8.Разрешение

Вестерберг и Свенссон [24] вывели уравнение для минималь­ ного А pH изоточек двух белков, достаточного для их разделе­ ния электрофокусированием:

Эти авторы [24] разделили миоглобины с A pi 0,06 на колонке объемом ПО мл при 1000 В в диапазоне pH 6,5—7,5. Используя коэффициент диффузии многлобина и ряд других параметров этого эксперимента, они рассчитали, что разрешение составляет 0,02 единицы pH. На этом основании авторы указывают, что «если разницу в изоточках двух белков удается зафиксировать с помощью хорошего pH-метра, то такие белки могут быть раз­ делены плавным электрофорезом». Эта теоретическая оценка разрешения подтверждена экспериментально [26, 45].

8.2.9.Достоверность полученных величин

Определение изоточек электрофокусированием дает большую экономию по сравнению с классическими методами. Если при электрофокусировании в одном опыте можно определить изо­ точки нескольких белков, то в случае метода движущейся гра­ ницы необходимо для каждого белка поставить около четырех опытов при четырех различных pH.

Кроме того, изоточка, найденная электрофокусированием, вероятно, должна быть близка изоионной точке, поскольку

320 ГЛАВА 8

раствор не содержит солен, а ионная сила амфолитов-носителей крайне низка. В единственном случае, когда можно было про­ вести сравнение, pi дезоксирибонуклеазы из 5. aureus, найден­ ная электрофокусированием [15, 51], оказалась очень близка изоионной точке [76] при условии введения температурной по­ правки [2]. Изоточки гемоглобинов [16] и миоглобинов [24], по­ лученные электрофокусированием, выше, чем в случае метода движущейся границы, что обусловлено связыванием анионов с белками при низкой ионной силе (обычно 0,1) рабочего раст­ вора. С другой стороны, при анализе цитохрома с, который не связывает анионы [25], оба метода дают одинаковые pi.

В случае электрофокусирования воздействие солей на изо­ точку практически исключается, однако следует все же учиты­ вать возможное влияние на белки сахарозы и амфолитов-носи­ телей. Отрицательное воздействие на pi сахарозы наблюдалось в случае основного белка — цитохрома с (pi выше 10) [25]. В этом случае истинное значение pi было найдено путем экстраполя­ ции на нулевую концентрацию сахарозы. Влияние сахарозы связано, вероятно, с изменением константы диссоциации ами­ ногрупп белка вследствие более низкой диэлектрической посто­ янной среды. Показано, что в некоторых случаях pi не зависит от концентрации сахарозы.

В настоящее время отсутствуют прямые доказательства влияния амфолитов-носителей на pi. Тот факт, что величина pi не зависит от концентрации амфолитов-носителей [24] и в неко­ торых случаях от присутствия 6 М мочевины [28], свидетель­ ствует о том, что амфолиты не образуют комплексов с белками. Электростатическое взаимодействие между белком и амфоли­ тами с одинаковыми изотбчками должно быть минимальным при плавном электрофокусировании, когда оба компонента имеют нулевой суммарный заряд. Таким образом, любое обра­ тимое взаимодействие белка и амфолита при значениях pH, да­ леких от их изоточек, не должно сказываться на результатах фракционирования. Однако нельзя совсем исключить возмож­ ность комплексообразования.

С другой стороны, вполне возможно, что белок будет агрегировать в изоточке при низкой ионной силе. Доказатель­ ством этого служат результаты электрофокусирования арилсульфатаз [59].

8.3.ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ В ГЕЛЕ

Кдостоинствам метода электрофокусирования в градиенте . плотности можно отнести возможность препаративного разделе­ ния, а также определения точного значения изоэлектрической точки. Однако как аналитический метод электрофокусирование

322 ГЛАВА 8.

некоторые получали гель в виде плоского блока. В целом при­ бор для работы в геле цилиндрической формы проще в изготов­ лении и легче в эксплуатации. Однако блоки обладают тем пре­ имуществом, что позволяют наносить несколько образцов одно­ временно и тем самым сопоставлять их в одинаковых условиях. Кроме того, после образования геля образец и амфолиты-носи­ тели можно вносить по всей торцевой грани блока. В последую­ щем разделе приводится методика для проведения электрофо­ кусирования в трубках размером 65 X 5 мм. Эта методика вполне применима при работе в геле, сформированном в виде блока.

8.3.2.Аппаратура

8.3.2.1. Прибор для электрофокусирования

Электрофокусирование можно проводить на приборе, пред­ ложенном Дэвисом [99] для проведения диск-электрофореза. Вы­ пускается множество вариантов этого прибора [78, 80, 92, 93],