книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков

122.Macko V., Stegman Н., Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 350, 917 (1969).

123.Vesterberg 0., Sci.-Tools, 16, 24 (1969).

124.Blati W. F., Hudson B. G„ Anal. Biochem., 26, 329 (1968).

125.Nilsson P., Wadstrom T., Vesterberg 0., Anal. Biochem., in press.

126.Valmet £., Sci. Tools, 16, 8 (1969).

127.Aw4eh Z. L, Williamson A. R., Askonas B. A., Biochem. J., 116, 241

(1970).

128. Haglund H., in «Methods of Biochemical Analysis», v. 19, Ed. by D. Glick, Interscience Publishers, Inc., New York, 1971.

129. Veterberger 0., in «Methods in Microbiology», Ed. by J. R. Norris and D. W. Ribbons, Academic Press, New York, in press.

i

Г Л А В А 9

Доступность для реагентов и окружение аминокислотных остатков в нативных белках

К. Шибата

9.1.АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ

ВНАТИВНЫХ БЕЛКАХ

Взависимости от положения в нативной структуре остатки аминокислот могут находиться в различном состоянии. Одни из них маскированы в глубине молекулы, другие доступны для

растворителя. Кроме того, состояние аминокислоты в значитель­ ной мере определяется ее непосредственным окружением. На­ пример, образование водородной связи между боковыми цепями аминокислот изменяет их химические и физикохимические свой­ ства, а каталитические функции ферментов осуществляются в результате согласованного действия некоторых аминокислотных остатков, определенным образом сгруппированных в активном центре. Естественно, непосредственное окружение оказывает влияние и на доступность аминокислотных остатков действию химических реагентов.

В последние годы исследованию окружения аминокислотных остатков в белках и их доступности для реагентов уделяется особенно много внимания, что объясняется многими причинами. Во-первых, познание реакционной способности каждого амино­ кислотного остатка в связи с непосредственным окружением приведет к пониманию различных химических свойств белков и ферментов. Например, механизм действия ферментов можно описать с точки зрения сродства и повышенной реакционной способности аминокислотных остатков активного центра по от­ ношению к субстрату. Во-вторых, доступность аминокислотных остатков действию реагентов зависит от конформационных из­ менений белков, вызываемых сменой pH, температуры, ионной силы, взаимодействием с субстратом и т. д. Изучая доступность для реагентов отдельных остатков в различных условиях, можно делать выводы о структуре нативных белков. В-третьих, моляр­ ные доли остатков в различных состояниях обычно определяют путем измерения кругового дихроизма (дисперсии оптического вращения), параметров ионизации, спектральных смещений при образовании водородных связей или других изменений в окру­

жении. Однако эти методы не дают сведений относительно при­ надлежности какого-либо аминокислотного остатка определен­ ному состоянию. Помечая отдельные остатки специфическими реагентами, а затем определяя последовательность соответ­ ствующего участка обычными методами, можно локализовать модифицированные аминокислоты в полипептидной цепи. В-чет- вертых, окружение отдельных аминокислотных остатков в бел­ ках можно исследовать в помощь различного типа бифункцио­ нальных реагентов.

9.2. ТИПЫ РЕАГЕНТОВ

Реагенты, пригодные для исследования реакционной способно­ сти, должны содержать по крайней мере одну функциональную группу, способную взаимодействовать с определенной аминокис­ лотой. В связи с этим подобного рода «монофункциональные»

циональных» реагентов. Реагенты первого типа R—О—R содержат две реакционноспособные группировки. При обработке такими реагентами белков образуются внутри- и межмолекуляр­ ные связи. Реагенты второго типа имеют аналогичную группи­ ровку R, а также группу А, обладающую специфическим срод­ ством к боковой цепи одной из аминокислот. Благодаря этой группе реагент сорбируется на определенном участке, например в области связывания, узнавания или на регуляторном участке фермента, а также в областях с иными свойствами, например, на гидрофобных, основных или кислотных, положительно или от­ рицательно заряженных областях или участках белковой моле­ кулы. Реагенты третьего типа обозначаются S—О—А или S—О—R, где S означает «сигнальную» группировку. При сорб­ ции или химическом связывании такой группировки с участком белковой молекулы она (благодаря изменению окраски, флуо­ ресценции или спинового состояния) передает информацию о своем непосредственном окружении.

Строго говоря, в качестве монофункциональных реагентов выступают лишь очень простые соединения. Часть молекулы О может оказывать влияние на реакционную способность R или степень сродства А, а также в какой-то мере взаимодействовать с остатками аминокислот, а группы R или S бифункциональных реагентов могут выступать как группы сродства. Однако это об­ стоятельство не снижает значимости подобного упрощения в классификации реагентов.

9.3.АНАЛИЗ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ

СПОМОЩЬЮ МОНОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ ТИПА R—О

Реагент, применяющийся для анализа реакционной способ­ ности аминокислотных остатков в нативных белках, должен удовлетворять следующим условиям: а) вступать в реакцию с боковыми цепями немногих аминокислот, предпочтительно с од­ ной аминокислотой; б) реагировать в условиях, при которых большинство белков остается в нативном состоянии, т. е. при комнатной температуре и нейтральном pH; в) обладать умерен­ ной реакционной способностью, т. е. вступать в реакцию со сво­ бодными или доступными для растворителя остатками и не реагировать с маскированными остатками или связанными бо­ ковыми цепями; г) обеспечивать определение степени прохожде­ ния реакции простыми методами, например абсорбционной спек­ трофотометрией, спектрометрией ЭПР, флуориметрией, включе­ нием радиоактивной метки и т. д.; д) меченые реагентом остатки должны легко идентифицироваться в пептидах после деградации модифицированного белка; этот анализ не сложен, когда реагент представляет собой радиоактивную или флуоресцентную метки, И все же ни один реагент не удовлетворяет полностью указан­ ным условиям. Поэтому выбор его определяется задачами экспе­ римента и свойствами исследуемого белка.

9.3.1.Тирозин

9.3.1.1.Параметры ионизации

При ионизации тирозина полоса поглощения неионизированной формы становится более интенсивной и смещается в область 295 нм. Поэтому, измеряя прирост поглощения АЕ при 295 нм и

циальном спектре нейтральных и щелочных растворов тирозина или белка имеется другой максимум при 242—244 нм [2,3]. Кри­ вые ионизации бромелаина, снятые при этих длинах волн, иден­ тичны [4].

Начиная с первых опытов Краммера и Нойбергера [5] спект­ рофотометрическое титрование применяют для выявления со­ стояния остатков тирозина. Свободный тирозин в нейтральной среде ионизуется при добавлении щелочи мгновенно; рК сигмо­

Рис. 1. Кривые ионизации трипсина.

д —теоретические кривые ионизации для 6 остатков с рК— 10,0 (т = 1 ) и для 4 остатков с рК=10,8 (т = 2 ). Кривая д получена путем вычитания теоретической кривой г из экспериментально найденных величин для кривой в [6).

тирозина в белках обладают различными свойствами: они харак­ теризуются значением рК выше 10, 0, т > 1, и медленной ско­ ростью ионизации. Если т~> 1, это означает, что на ионизацию данного остатка тирозина расходуется более одного моля щело­ чи. Например, при т == 2 на высвобождение маскированного или связанного остатка тирозина расходуется дополнительно еще один моль щелочи. Другим признаком, по которому можно различать остатки тирозина, является скорость ионизации. На­ пример, для ионизации одного из четырех остатков тирозина в инсулине при pH 12,0 необходимо несколько часов [1], тогда как другие остатки ионизируются мгновенно.

На рис. 1 показано два типа остатков тирозина в трипсине {6]. Кривые б и в , снятые сразу и спустя 3 ч после добавления щелочи, свидетельствуют о мгновенной ионизации при pH 10,0 (т — 1) 6 остатков тирозина из 10 и медленной ионизации ос­ тавшихся 4 остатков при pH выше 11,4. Кривая д, полученная путем вычитания кривых в и г , дает для этих медленно ионизую­ щих остатков значение рК = 10,8 ( т = 2). После денатурации трипсина 3,2 М гуанидином все 10 остатков характеризуются рК 10,0 (т = 1) и ионизуются мгновенно.

Параметры ионизации остатков тирозина в белках приво­ дятся в ряде работ [1—4, 6—19, 57, 62, 64—66]. Эти данные

Продолжение табл. 1

Продолжение табл. 1

а.

—число остатков, не вступающих в реакцию или не способных к ионизации. П р и н я т ы е о б о з н а ч е н и я .

i f —общее число остатков тирозина.

п 1. п2 п1~ числ0 возможных состояний с различной реакционной способностью или параметрами ионизации.

обр.—обратимая ионизация. необр.— необратимая ионизация.

б. —быстро, т. е. высокая скорость ионизации. м.—медленно, т. е. низкая скорость ионизации.

сведены в табл. 1, где щ означает, общее число остатков тиро­ зина в молекуле белка, а Пг — число возможных состояний, т. е. остатков, характеризующихся различной реакционной способно­ стью или параметрами ионизации.

Цианурфторид [20] реагирует с тирозином и боковыми цепя­ ми некоторых аминокислот, например с амино- и сульфгидрильными группами, но не взаимодействует с другими ароматичес­ кими аминокислотами. После реакции с цианурфторидом полоса поглощения тирозина в УФ-области исчезает. Цианурфторид устойчив в диоксане, но медленно гидролизуется в воде с обра­ зованием циануровой кислоты. Ни циануровая кислота, ни.про­ дукты реакции с аминокислотами не поглощают в области выше 290 нм. При взаимодействии ЦФ с белком оба процесса, гидро­ лиз реагента и реакция с остатками аминокислот, включая ти­ розин, идут одновременно. Оптимальная область pH для моди­ фикации остатков тирозина составляет 9,0—12,6. Продукт реак­ ции с аминогруппой гидролизуется до свободной кислоты при обычном кислотном гидролизе. Степень замещения можно опре­ делять дифференциальной спектрофотометрией в сравнении с интактным тирозином, не модифицированным ЦФ. Для этого реакционную смесь разделяют на две части: в одной половине поддерживают нейтральное pH, другую подщелачивают до 12,6. Разница в поглощении между двумя растворами позволяет рас­ считать концентрацию тирозина. Добавление гуанидина способ­ ствует полной ионизации некоторых маскированных остатков ти­ розина.

При действии ЦФ на инсулин (pH 9,0) оказалось [20, 21], что из 4 остатков тирозина Туг А19 и Туг В16 реакционноспособны, а Туг А14 и Туг В26 инертны (см. рис. 2). Присутствие щелочи довольно быстро активирует Туг В26, тогда как активация Туг А14 длится несколько часов. По-видимому, именно эти остатки обнаруживаются по спектральным смещениям при триптическом гидролизе инсулина или подкислении триптического гидролизата [22—25]. Присутствие двух аномальных остатков тирозина уста­ новлено также по оценке влияния растворителя на спектр по­ глощения [26].

Ацетилимидазол, изучавшийся Валле с сотр. [12, 13, 27, 28], пригоден для ацетилирования оксигруппы остатков тирозина в белках [27—29]. При образовании N.O-диацетилтирозина по­ лоса поглощения N-ацетилпроизводного Vax 275 нм, 8275 = 1370