книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков
..pdf
336 ГЛАВА 8
разрешение зон будет выше, чем при элюировании с препара тивной колонки (см. разд. 8.2.5.10).
Благодаря высокому разрешению электрофокусирование в геле можно использовать для препаративного выделения белков, элюируя компоненты с отдельных кусочков геля. Местоположе ние зон определяют по отношению к окрашенным маркерам, окрашиванием отдельных полосок геля (при работе в блоке) или измерением pH на поверхности геля с помощью стеклянного микроэлектрода (см. разд. 8.3.3.5). Однако извлечение белка с геля является довольно сложным, поэтому таким методом мож но приготовить лишь незначительные количества вещества. Либек и Руттер [89] описали другой метод препаративного раз деления в геле, позволяющий работать с 30 мг белка. В этом случае образец наносят в щель на блоке геля. После фокуси рования компонент увлекается эндоосмосом во вторую щель, от куда вымывается поперечным потоком элюента.
8.3.6.Электрофокусирование на бумаге
Бумагу использовали в качестве пористой среды для изоэлектрического фракционирования в искусственных градиентах pH [115, 116], однако такая методика не получила распростране ния, частично из-за трудности создания искусственного градиента pH. Более удовлетворительные результаты получаются при использовании синтетических амфолитов-носителей, дающих естественный градиент pH. По сравнению с гелем бумага более удобна в обращении. Кроме того, здесь легче удалять амфо литы, поскольку белки могут быть подвергнуты тепловой дена турации непосредственно на бумаге; к тому же белки легче сни маются с бумаги после фракционирования. Для окрашивания белков на бумаге в присутствии амфолитов-носителей при меняют водный раствор, содержащий 0,05% бромфенолового синего, 1% хлористой ртути и 2% уксусной кислоты [117]; при этом предварительно высушенную в сушильном шкафу электрофореграмму погружают в горячий 10%-ный раствор ТХУ. Ин тенсивность окраски можно увеличить, выдерживая высушенную бумагу в атмосфере аммиака.
Эндоосмос, обусловленный наличием в большинстве сортов бумаги ионогенных группировок, снижает стабильность гради ента pH, особенно при pH выше 8. При работе на ватмане № 1 влияние эндоосмоса удается в значительной мере устранить; для этого бумагу пропитывают 1,2%-ным раствором амфолитов в 0,01 М хлористом натрии, а также поддерживают ее в прямом контакте с графитовыми электродами, погруженными соответ ственно в 0,2%:ную серную кислоту и 0,4%-ный раствор этаноламина. При работе на специальных сортах бумаги присутствие
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКА |
337 |
хлористого натрия не обязательно, поскольку в этом случае эндоосмос практически отсутствует {118]. Обычно используют полоски указанных сортов бумаги длиной 15 см и градиент на пряжения ~ 20 В/см. В этих условиях градиент pH устойчиво сохраняется в течение 2 ч. При этом гемоглобин фокусируется в области его изоточки, но не разделяется на компоненты. В ходе исследований было показано, что при электрофокусировании на бумаге достигается более низкое разрешение белков и амфотер ных красителей, чем при фракционировании в геле. Однако этот метод, возможно, найдет применение, для фракционирования не которых классов соединений низкого и среднего молекулярного веса или для разделения в одном направлении при получении пептидных карт.
8.4.ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ И ДРУГИЕ МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ
8.4.1.Основы фракционирования электрофокусированием
Фракционирование электрофокусированием основывается, повидимому, исключительно на различии в изоэлектрических точ ках. Большинство других методов используют различие в одном или нескольких иных свойствах, например растворимости, раз мерах, форме или заряде молекул. (Исключение составляют элюирование в градиенте pH на ионообменниках [119] и электродекантация [120].) Поскольку при разделении белков электро-
;фокусированием используются различные свойства этих соеди нений, можно надеяться, что набор разделяемых компонентов в этом случае будет иным, чем при разделении другими методами. Иногда так и получается [30, 88, 94], но не в случае сходных белков, например изоферментов [25, 26, 32].
8.4.2.Сочетание методов электрофокусирования
иэлектрофореза в геле
Сочетание электрофореза и электрофокусирования в геле оказалось в ряде случаев удобным методом двумерного анализа белка. Множество компонентов, присутствующих в сыворотке крови, не могут быть однозначно идентифицированы каким-либо одним методом. Их вначале разделяют электрофокусированием в столбике геля, а затем электрофорезом в перпендикулярном направлении в блоке геля [86, 88, 91]. Полученная таким путем двумерная карта (рис.'17) используется при диагностике забо леваний. Этот метод, называемый также методом «белковых
340 |
ГЛ АВА 8 |
[26, 39, 45]. Высокое разрешение при электрофокусировании обусловлено, как уже отмечалось, отчасти сжатием зон, а также тем обстоятельством, что любую часть изоэлектрического спект ра можно растянуть на всю длину колонки с помощью пологого градиента. Это свойство электрофокусирования обеспечивает достижение высокой степени очистки в одну стадию.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Haglund Я , Sci. Tools, 14, 17 (1967).
2.Vesterberg О., Svensk. Кеш. Tidskr., 80, 213 (1968).
3.Peeters H. (ed.), Protides Biol. Fluids, Proc. 16th Colloq., 1968, Pergamon Press, London, 1969.
4.Peeters H. (ed.), Protides Biol. Fluids, Proc. 17th Colloq., 1969, Pergamon Press, London, 1970.
5.Edsall I. T., Wyman J., Biophysical Chemistry, Vol. 1, Academic Press, New York, 1958.
6.Bier M. (ed.) Electrophoresis: Theory, Methods and Applications, Academic Press, New York, 1957.
7.Florkin M., Stotz E. H., Comprehensive Biochemistry, Vol. 7, Part I, Elsevier, Amsterdam, 1963, p. 23, 113.
8.Kotin A., in «Methods of Biochemical Analysis», Vol. 6, Ed. by D. Glick, Interscience, New York, 1958, p. 259.
9.Svensson H., Acta Chem. Scand., 15, 325 (1961).
10.Kotin A., Proc. Acad. Sci. U. S„ 41, 101 (1955).
11.Svensson H., Advan. Protein Chem., 4, 251 (1948).
12.Svensson H„ Acta Chem. Scand., 16, 456 (1962).
13. Svensson H., in «Protides Biol. Fluids, Proc. 15th Colloq., 1967», Ed. by
H. Peters, Elsevier, Amsterdam, 1968, 515.
14.Vesterberg 0., Acta Chem. Scand., 23, 2653 (1969).
15.Vesterberg O., Wadstrom T., Vesterberg K., Svensson H., Malmgren B.t
Biochim. Biophys. Acta, 133, 435 (1967).
16.Svensson H., Arch. Biochem. Biophys., Suppl. 1, 1962, 132.
17.Svensoon H., in «А Laboratory Manual of Analytical Methods of Protein Chemistry», Vol. 1, Ed. by P. Alexander and R. J. Block, Pergamon Press, London, 1960, 193.
18.Svensson H., Pettersson S., Separ. Sci., 3, 209 (1968).
19.Jonsson M., Pettersson £., Acta Chem. Scand., 22, 712 (1968).
20.Dempster К. T., Spectrovision No. 18, 1968, 5.
21.Valrnet E., Sci. Tools, 15, 8 (1968).
22.Rust P„ Anal. Biochem., 17, 316 (1966).
23.Tappan D. V., Anal. Biochem., 18, 392 (1967).
24.Vesterberg O., Svensson H„ Acta Chem. Scand., 20, 820 (1966).
25. Flatmark T., Vesterberg O., Acta Chem. Scand., 20, 1497 (1966).
26.Carlstrom A., Vesterberg O., Acta Chem. Scand., 21, 271 (1966).
27.Petterson U., Philipson L., Hoglund S., Virology, 35, 204 (1968).
28.Wadstrom T., Biochim. Biophys. Acta, 168, 228 (1968).
29.Jeppsson J. O., Biochim. Biophys. Acta, 140, 468 (1967).
30.Brown D. G., Baron C., Abrams A., Biochim. Biophys. Acta, 168, 386 (1968).
31.Bjork / , Acta Chem. Scand., 22, 1355 (1968).
32.Bloemendal H., Shoenmakers J. G. G., Sci. Tools, 15, 6 (1968).
33.Schoenmakers J . G. G., Bloemendal H., Nature, 220, 790 (1968).
34.Grasbeck R„ Acta Chem. Scand., 22, 1041 (1968).
|
ЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ БЕЛКА |
341 |
35. |
Vesterberg О., Berggren В., Arkiv. Kemi, 27, 119 (1967). |
Scand., 21, 937 |
36. |
Ahlgreti E., Eriksson K.-E., Vesterberg 0., Acta Chem. |
|
|
(1967) . |
|
37.Mach 0., Lacko L., Anal. Biochem., 22, 393 (1968).
38.Kamat V. B., Wallach D. F. H., Science, 148, 1343 (1965).
39.Quast R., Vesterberg 0., Acta Chem. Scand., 22, 1499 (1968).
40.Wenn R. V., Williams J., Biochem. J., 108, 69 (1968).
41.Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951).
42.Gornall A. G., Bardawill C. J., David M. M., J. Biol. Chem., 177, 751 (1949).
43.Goa /., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 5, 218 (1953).
44.Earland C., Ramsden D. B., J. Chromatog., 35, 575 (1968).
45.Vesterberg 0., Acta Chem. Scand., 21, 206 (1967).
46. Paleus |
Vesterberg |
0., Intern. Symp. |
Comparative |
Hemoglobin |
Structure, |
M. Triantolylo |
Sons Publishers, |
Thessaloniki, |
Greece, 1966, |
p. 149.
47.Grasbeck R., in «Protides Biol. Fluids, Proc. 16th Colloq., 1968», Ed. by
H. Peeters, Pergamon Press, London, 1969, p. 401.
48.Grasbeck R., Visuri K., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 101, 13 (1968).
49.Flodh H., Bergrahm B., Oden B., Life Sci., 7, 155 (1968).
50.Aares E., Closs K-, Lehmann F., Sci. Tools, 15, 36 (1968).
51.Wadstrom T„ Biochim. Biophys. Acta, 147, 441 (1967).
52.Vesterberg O., Biochim. Biophys. Acta, 168, 218 (1968).
53.Jonsson M., Pettersson E., Reinhammer B., Acta Chem. Scand., 22, 2135
(1968) .
54.Ahlgren E., Eriksson К. E., Acta Chem. Scand., 21, 1193 (1967).
55.Bucht B., Eriksson /<. E., Arch. Biochem. Biophys., 124, 135 (1968).
56.Li Y.-P., Li S.-С., J. Biol. Chem., 243, 3994 (1968).
57.Sandhoff K-, Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem., 349, 1095 (1968).
58.Bernheimer A. W., Grushoff P., Avigad L. S., J. Bacteriol., 95, 2439
(1968).
59.Allen E., Roy A. B., Biochim. Biophys. Acta, 168, 243 (1968).
60.Weller D. L., Heaney A., Sjogren R. E., Biochim. Biophys. Acta, 168, 576 (1968).
61.Mitchell W. M., Biochim. Biophys. Acta, 178, 194 (1969).
62.Rebeyrot P., Labbe J. P., Compt. Rend., Ser. D, 268, 1125 (1969).
63. Berndt W., Hoffman U., Muller-Wieland /(., Z. Gastroenterol., 6, 185 (1968) .
64.Catsimpoolas N., Arch. Biochem. Biophys., 131, 185 (1969).
65.Van Baelen H., Heyns W., DeMoor P., Ann. Endocrinol. (Paris), 30, 199 (1969) .
66.Kaplan L. J., Foster J. F., Federation Proc., 28, 865 (1969).
67.Reis H. E., Wetter O., Klin Wochschr., 47, 426 (1969).
68.Pechet L.. Smith I. A., Federation Proc., 28, 828 (1969).
69.Smith M. B., Back J. F., Proc. Australian Biochem. Soc., 13th Meeting, 1969, 36.
70.Toom P. M., Squire P. G., Tu A. T„ Federation Proc., 28, 903 (1969).
71.Weber T., Grasbeck R., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 101, 14 (1968).
72.Herschman H. R., Helinski D. R., J. Biol. Chem., 242, 5360 (1967).
73.Jonsson M., Pettersson E., Sci. Tools, 15, 2 (1968).
74 Schultze H. E., Heremans J. F., Molecular |
Biology of |
Human |
Proteins, |
Vol. 1, Elsevier, Amsterdam, 1966, p. 176. |
W., Cereal |
Chem., |
46, 357 |
75. Catsimpoolas N., Ekenstam C., Meyer E. |
|||
(1969). |
|
|
|
76.Heins J. N., Suriano J. R., Taniuchi H., Anfinsen С. B., J. Biol. Chem., 242, 1016 (1967).
342 |
ГЛАВА 8 |
77.Catsimpoolas N., Ekenstam C., Meyer E. IF., Biochim. Biophys. Acta. 175. 76 (1969).
78.Riley R. F., Coleman M. /<., J. Lab. Clin. Med., 72, 714 (1968).
79.Awdeh Z. L., Williamson A. R., Askonas B. A., Nature, 219, 66 (1968).
80.Catsimpoolas N., Anal. Biochem., 26, 480 (1968).
81.Catsimpoolas N., Biochim. Biophys. Acta, 175, 214 (1969).
82.Catsimpoolas N., Immunochemistry, 6, 501 (1969).
83.Catsimpoolas N., Sci. Tools, 16, 1 (1969).
84.Catsimpoolas N., Clin. Chim. Acta, 23, 237 (1969).
85.Dale G., Latner A. L., Lancet, 1, 847 (1968).
86.Dale G., Latner A. L„ Clin. Chim. Acta, 24, 61 (1969).
87.Fawcett J. S„ FEBS Letters, 1, 81 (1968).
88.Kenrick K. G., Margolis J., Anal. Biochem., 33, 204 (1970).
89.Leaback D. H., Rutter A. C., Biochem. Biophys. Res. Commun., 32, 447 (1968).
90.Wrigley C. W., J. Chromatog., 36, 362 (1968).
91.Wrigley C. IF., Sci. Tools, 15, 17 (1968).
92. Wrigley C. IF., Shandon Instrument Applications, 29, 1 (1969).
93.Wrigley C. IF., Instructions for Performing Gel Electrofocusing, Buchler Instruments, Inc., Fort Lee, N. J., 1970.
94.Wrigley C. IF., Biochem. Genet., 4, 509 (1970).
95.Wrigley C. IF., Moss H. J., in «Proc. Third Intern. Wheat Genetics Symp.», Ed. by K. W. Finlay and K. W. Shepherd, Butterworth, Sydney, Australia, 1968, p. 439.
96.Chrambach A., Anal. Biochem., 15, 544 (1966).
97.Aronson J. N., Boris D. P., Anal. Biochem., 18, 27 (1967).
98.Gressel J., Wolowelsky J., Anal. Biochem., 22, 352 (1968).
99.Davis B. J., Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404 (1964).
100.Huebner F. R.. Rothfus J. A., Wall J. S., Cereal Chem., 44, 221 (1967).
101.Schwabe C., Anal. Biochem., 17, 201 (1966).
102.Prusik Z., J. Chromatog., 32, 191 (1968).
103.Chrambach A., Reisfeld R. A., Wycoff AL, Zacchari J., Anal. Biochem., 20, 150 (1967).
104.Luner S. J., Anal. Biochem., 23, 357 (1968).
105.Wieme R. J., Agar Gel Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam, 1965, p. 80, 135.
106.Brewer J. AL, Science, 156, 256 (1967).
107.Mitchell IF. M., Biochim. Biophys. Acta, 147, 171 (1967).
108.Fantes К. H., Furminger I. G. S., Nature, 215, 750 (1967).
109.Schyns R., J. Chromatog., 36, 549 (1968).
110.Bennick A., Anal. Biochem., 26, 453 (1968).
111. Ringborg U., Egyhasi E., Daneholt B., Lambert B., Nature, 220, 1037 (1968).
112.Peacock A. C., Dingman C. W., Biochemistry, 7, 668 (1968).
113.Whitaker J., Electrophoresis in Stabilizing Media, Academic Press, New York, 1967.
114.Latner A. L., Skillen A. W., Isoenzymes in Biology and Medicine, Aca demic Press, London, 1968.
115.Hoch H., Barr G. Я., Science, 122, 243 (1955).
116.McDonald H. J., Williamson M. B., Naturwiss., 42, 461 (1955).
117.Kunkel H. G., Tiselius A., J. Gen. Physiol., 35, 89 (1951).
118.Stegmann H., Naturwiss., 43, 518 (1956).
119.Lampson G. P., Tytell A. A., Anal. Biochem., 11, 374 (1965).
120.Poison A., Largier I. F„ in «А Laboratory Manual of Analytical Methods of Protein Chemistry», Vol. 1, Ed. by P. Alexander and R. J. Block, Perga-, mon Press, London, 1960.
121.Margolis J., Kenrick К. G., Nature, 221, 1056 (1969),