диссертации / 10

121

Следующим этапом наших исследований неспецифического влияния инку-

бации в течение 60 мин при 37˚С стало изучение праймирующей способности ПМЛ к секреции АФК при остром деструктивном панкреатите. Данное заболе-

вание протекает в двух клинико-морфологических формах – это асептично и с инфицированием очагов панкреатогенной деструкции и, в дальнейшем, с разви-

тием гнойно-септических осложнений. До сих пор не найдено однозначного отве-

та на вопрос, почему у одних пациентов процесс протекает асептично и благо-

приятно разрешается, а в других случаях инфицируется и может осложняться?

Некоторые исследователи считают, что изменение баланса про- и противовоспа-

лительных цитокинов в сторону провоспалительных цитокинов связано с тяже-

стью заболевания и выраженностью системной воспалительной реакции, а также может вызывать клеточную иммунодепрессию или истощение при ОДП [77].

На наш взгляд, изменение праймирующей способности к секреции АФК ПМЛ еще в кровеносном русле под влиянием различных неспецифических и специфи-

ческих факторов может свидетельствовать о возможном истощении ПМЛ в очаге деструкции и также быть одним из ранних маркеров возможного инфицирования воспалительного процесса. При исследовании праймирующей способности к сек-

реции АФК ПМЛ в ответ на влияние инкубации в течение 60 мин при 37˚С у всех пациентов с ОДП нами было выявлено снижение данной способности. В

группе с асептическим течением ОДП это снижение было выражено в меньшей степени и составляло всего 13,9-19,0%. Причем за счет нарушения активности МПО и СОД. НАДФН-оксидазная активность ПМЛ, в случае асептичного тече-

ния воспалительного процесса в поджелудочной железе, была повышена на 51,0- 58,1% по сравнению с донорами. Однако при инфицированном ОДП снижение способности к праймированию секреции АФК ПМЛ было более выражено и со-

ставляло 47,1- 49,4% по сравнению с донорами, и проявлялось в нарушении ак-

122

тивности всех кислородозависимых ферментных систем ПМЛ, в том числе и НАДФН-оксидазы.

Таким образом, мы получили, что уровень секреции АФК ПМЛ крови в ис-

следуемых группах различен и способность к праймированию неспецифическим воздействием секреции АФК ПМЛ неодинакова. Поэтому у нас возникло предпо-

ложение о наличии в крови пациентов с инфицированным течением ОДП спе-

цифических факторов подавляющих секрецию АФК. Такими специфическими факторами могут быть микрорганизмы, участвующие в бактериальной трансло-

кации из кишечника при инфицировании очагов панкреодеструкции, а также их клеточные компоненты и продукты жизнедеятельности. По данным литературы наиболее часто высеваемыми возбудителями при инфицировании ОДП являются

Escherichia coli, Klebsiella spp, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa

[59; 120]. В связи с этим на следующем этапе работы были использованы ком-

плексные АГ данных микроорганизмов, состоящие из инактивированных цель-

ных бактерий, их разрушенных компонентов, и выделенных ими продуктов жиз-

недеятельности.

При изучении праймирующего влияния данных комплексных АГ на способ-

ность ПМЛ секретировать АФК нами было показано, что используемые ком-

плексные АГ бактерий предстимулируют секрецию АФК, в том числе и секрецию О2ˉ как у здоровых доноров, так и при асептическом течении ОДП. Причем у па-

циентов с асептическим течением предстимуляцию секреции АФК вызывал весь заданный диапазон концентраций комплексных бактериальных АГ. Что, на наш взгляд, свидетельствовало о гиперстимуляции ПМЛ еще в системном кровотоке и о повышенной функциональной готовности по отношению к бактериальному агенту. Для пациентов с инфицированным течением ОДП было характерно сни-

жение праймирующей способности к секреции АФК ПМЛ под влиянием бакте-

123

риальных комплексных АГ, в том числе и к секреции О2ˉ на всем диапазоне за-

данных концентраций.

Таким образом, данные результаты могут свидетельствовать о наличии де-

фектов в работе кислородозависимых ферментов ПМЛ при инфицированном те-

чении ОДП. Одним из таких дефектов может быть нарушение сборки компонен-

тов НАДФН-оксидазы в процессе прайминга ПМЛ бактериальными комплексны-

ми АГ и как следствие этого снижение секреции АФК, в том числе О2ˉ [50].

Для оценки возможности прогностического значения исследования секреции АФК посредством метода ХЛ нами было произведено определение суммарной секреции АФК ПМЛ, секреции О2ˉ и праймирующей способности ПМЛ секрети-

ровать АФК под влиянием бактериальных комплексных АГ в динамике развития ОДП (1-е, 3-е, 7-е и 14-е сутки стационарного лечения) у больных с асептической и инфицированной формой течения ОДП. На протяжении всего срока проводи-

мого исследования в группе пациентов, имеющих инфицированное течение ОДП,

наблюдались более низкие показатели уровня суммарной секреции АФК по срав-

нению с пациентами с асептическим течением ОДП. Наиболее выраженное уве-

личение уровня суммарной секреции АФК ПМЛ фиксировалось к 3-м суткам ста-

ционарного лечения у всех пациентов с ОДП. В то время, как НАДФН – оксидаз-

ная активность, оцениваемая по уровню секреции О2ˉ ПМЛ у пациентов с инфи-

цированным течением ОДП достигала максимума только к 7-м суткам, в отличие от пациентов с асептическим ОДП, у которых максимум фиксировался в 1-3 –е

сутки стационарного лечения. Получается, что при инфицированном течении ОДП уже на ранних сроках заболевания наблюдаются изменения кислородозави-

симого метаболизма ПМЛ, проявляющиеся в нарушении работы всех ферментных систем, ответственных за секрецию АФК. При изучении праймирующей способ-

ности к секреции АФК ПМЛ крови пациентов с инфицированным течением ОДП нами также были выявлены нарушения в работе кислородозивисмых ферментов ПМЛ на протяжении всего срока наблюдения. Величины ИП, характеризующие праймирущее влияние комплексных бактериальных АГ на секрецию АФК ПМЛ,

124

у пациентов с инфицированным течением ОДП были значительно ниже, чем у па-

циентов с асептическим ОДП с 1-х по 14-е сутки стационарного лечения. Также нами была отмечена особенность ПМЛ пациентов с асептическим течением ОДП

«отвечать» на высокие концентрации, подавляющие прайминг у ПМЛ доноров,

используемых бактериальных комплексных АГ значительным увеличением ИП более 1,5-2,0 (p<0,001). В то время как, у пациентов с инфицированным течением ОДП на данных концентрациях также происходило подавление эффекта праймин-

га ПМЛ. Данный наблюдаемый факт заложен в основу прогнозирования течения ОДП уже в 1-е сутки от начала заболевания еще до развития клинических прояв-

лений инфицирования. Те пациенты, у которых уже на 1-е сутки заболевания

ИП>1,0 с вероятностью p<0,001 в дальнейшем дадут картину асептического ОДП. Пациенты с ИП<1,0 с вероятностью p<0,05 составляют группу риска по развитию гнойно-септических осложнений ОДП и нуждаются в более присталь-

ном внимании врачей.

Таким образом, в нашей работе оценена и изучена важная роль ПМЛ в раз-

витии инфицирования очагов панкреатогенной деструкции при остром панкреа-

тите. Выявлено изменение кислородозависимого метаболизма и процессов прай-

минга ПМЛ при инфицировании ОДП засчет наличия дефекта в работе НАДФН-

оксидазной системы. Подтверждено предположение о возможной гиперстимуля-

ции ПМЛ еще в системном кровотоке, до миграции в очаг деструкции поджелу-

дочной железы при остром панкреатите.

В заключении надо отметить, что определение праймирующей способности ПМЛ к секреции АФК под влиянием комплексных АГ бактерий, участвующих в транслокации при ОДП, может являться ранним и специфическим маркером ин-

фицирования очагов панкреатогенной деструкции.

125

ВЫВОДЫ

1.Отработаны условия определения секреции активных форм кислорода поли-

морфно-ядерными лейкоцитами в норме. Показано праймирующее влияние инкубации в течение 60 мин при 37˚С на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами у доноров. Выявлено, что выделение по-

лиморфно-ядерных лейкоцитов из цельной крови изменяет данное влияние на секрецию активных форм кислорода в норме (суммарная секреция активных форм кислорода выделенными полиморфно-ядерными лейкоцитами доноров снижена на 169,0% по сравнению с таковой в цельной крови, а секреция О2ˉ

снижена на 15,0%).

2.При инфицированном течении острого деструктивного панкреатита наблюда-

ется снижение секреции активных форм кислорода, в т.ч. секреции О2ˉ по сравнению с пациентами, имеющими асептическое течение острого деструк-

тивного панкреатита (суммарная секреция активных форм кислорода снижена на 50,7%, а секреция О2ˉ снижена на 48,9%).

3.При остром деструктивном панкреатите в условиях инкубации in vitro секре-

ция активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови снижена по сравнению с донорами. При инфицированном течении острого де-

структивного панкреатита снижение секреции активных форм кислорода свя-

зано с нарушением работы всех кислородозависимых систем полиморфно-

ядерных лейкоцитов, в т.ч. со снижением активности НАДФН-оксидазы.

4.Исследуемые бактериальные комплексные антигены обладают праймирующим влиянием на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лей-

коцитами в норме и при асептическом течении острого деструктивного пан-

креатита. Одним из механизмов такого влияния является активация НАДФН-

оксидазы полиморфно-ядерных лейкоцитов.

5.При инфицированном течении острого деструктивного панкреатита выявлено снижение секреции активных форм кислорода при воздействии бактериаль-

126

ными комплексными антигенами на полиморфно-ядерные лейкоциты крови

(ИП<1,0). Одним из механизмов выявленного нарушения является снижение активности НАДФН-оксидазы.

6.По изменению секреции активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами при воздействии комплексных антигенов бактерий в первые су-

тки заболевания можно судить о течении патологического процесса. У пациен-

тов с ИП >1,0 вероятность развития гнойных процессов в поджелудочной же-

лезе составляет менее 0,1%. У пациентов с ИП<1,0 следует ожидать гнойно-

септических осложнений острого деструктивного панкреатита (p<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты по изучению праймирующего влияния комплексных антигенов Escheriсhia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa на секрецию АФК ПМЛ доноров могут использоваться как ре-

ферентные значения в экспериментальных работах по изучению праймирующей способности ПМЛ крови при других острых воспалительных заболеваниях.

С целью предупреждения развития гнойно-септических осложнений пред-

ложен прогностический алгоритм определения характера течения острого дест-

руктивного панкреатита в первые сутки заболевания.

.

127

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ – антиген АФК – активные формы кислорода

Г-КСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ИЛ – интерлейкин ИС – индекс стимуляции

ИП – индекс соотношения площадей под кривыми хемилюминесценции КТ – компьютерная томография ЛДГ – лактатдегидрогеназа

ЛИИ – лейкоцитарный индекс интоксикации ЛПС – липополисахарид ЛУК – ледяная уксусная кислота

Л-ХЛ – люминол-зависимая хемилюминесценция Лц-ХЛ – люцигенин-зависимая хемилюминесценция МРТ – магнитно-резонансная томография МПО – миелопероксидаза НСТ– нитросиний тетрозолий

НСТ-тест – тест восстановления нитросинего тетрозолия ОП – острый панкреатит ОДП – острый деструктивный панкреатит

ПМЛ – полиморфно-ядерный лейкоцит ПОЛ – перекисное окисление липидов СОД – супероксиддисмутаза СОЭ – скорость оседания эритроцитов СРП – С-реактивный протеин

УЗИ – ультразвуковое исследование ФМА – форбол-миристат ацетат ФНОα – фактор некроза опухоли альфа

128

ХЛ – хемилюминесценция ЩФ – щелочная фосфатаза

анти- ICAM-1 – антительная сыворотка против адгезивного белка клеточной по-

верхности эндотелиоцитов

антагонист R ИЛ-1 – антагонист рецептора интерлейкина 1

Н2О2 – перекись водорода

ICAM-1 – адгезивный белок клеточной поверхности эндотелиоцитов 1

С5а – компонент комплемента 5а

MCP-1 – моноцитарный хемоаттерактант протеин 1

ММР-9 – матричная металлопротеиназа 9

NO – оксид азота

1О2 – синглетный кислород О2ˉ – супероксид анион радикал кислорода

PAF – тромбоцит активирующий фактор

PAMP – патоген-ассоциированный молекулярный паттерн

TLR – Toll-подобные рецепторы

sTNFR – растворимые рецепторы фактора некроза опухоли

129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Адо, А.Д. Современная практическая аллергология / А.Д. Адо, А.А. Польнер. - М.: Медгиз, 1963.-399с.

2.Активированная люцигенином хемилюминесценция тканей животных/ Н.С. Матвеева, О.Б. Любицкий, А.Н.Осипов, Ю.А. Владимиров //Биофизика сложных систем.-2007.- Т.52. - №6. – С.1120-1127.

3.Багненко, С.Ф. Современные представления о тактике лечения острого панкреатита / С.Ф. Багненко, А.Д. Толстой, В.Р. Гольцов //Актуальные вопросы диагностики и хирургического лечения заболеваний органов брюшной полости: сб. статей. – СПб.- 2005. – С. 127-129.

4.Балаклеец, Е.Н. Активация нейтрофильных лейкоцитов системы верхней полой и воротной вен у больных острым панкреатитом/ Е.Н. Балаклеец, А.А. Славинский, А.Н. Лищенко // Кубанский научный медицинский вест- ник.-2010.-№9 (123).-С.31-33.

5.Балачевский, Б.В. Воздействие даларгина на функционально-

метаболическую активность нейтрофилов крови при остром экспериментальном панкреатите/ Б.В. Балачевский, А.Н. Курзанов, А.А. Славинский//

Кубанский научный медицинский вестник.-2006.-№10.-С.15-17.

6.Барсук, А.В. Активация нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных острым панкреатитом /А.В. Барсук, В.В. Нарсия, А.А. Славинский //MODERN HIGH TECHNOLOGIES.-2012.-№8.- С.8-9.

7.Барсук, А.В. Антибактериальные катионные белки нейтрофильных лейкоцитов в динамике развития острого панкреатита/ А.В. Барсук, В.В. Нарсия, А.А. Славинский //Международный журнал экспериментального образова- ния.-2012.- №6.- С.9.

8.Будихина, А.С. Новый метод определения бактерицидной активности биологических жидкостей с помощью лазерной проточной цитофлюоромет-

130

рии/ А.С. Будихина, Н.С. Олиферук, Б.В. Пинегин //Иммунология.-2006.-

Т.27.-№4.-С.249-252.

9.Вельков, В.В. Прокальцитонин и С-реактивный белок в современной лабораторной диагностике / В.В. Вельков // Клинико-лабораторный консилиум.- 2008.-№6.-С.46-52.

10.Владимиров, Ю.А. Стимулированная кристаллами сульфата бария хемилюминесценция лейкоцитов цельной крови / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев, А.П. Пирязев // Биофизика.-1989.-Т.34.-№6.- С.1051-1054.

11.Владимиров, Ю.А. Хемилюминесценция в биологических системах. /Ю.А. Владимиров //Природа.-1997.-№3.-С.18-28.

12.Владимиров, Ю.А. Хемилюминесценция клеток животных / Ю.А. Владимиров, М.П. Шерстнев // Итоги науки и техники. Серия Биофизика / под ред. М.Н. Мерзляка - М.:ВИНИТИ, 1989 – Т. 24.-176с.

13.Военков, В.Л. Регуляторные функции активных форм кислорода в крови и в водных модельных системах: автореф. дис.…д-ра биол. наук: 03.0013; 03.00.02 / Военков Владимир Леонидович. – М., 2003. - 23с.

14.Гематологический атлас: настольное руководство врача-лаборанта / Г.И. Козинец, Т.Г. Сарычева, С.А. Луговская и др. - М.: Практическая медицина,

2008.-187с.

15.Годков, М.А. Хемилюминесцентный анализ нейтрофилов неразделенной крови в клинической практике: автореф. дис…. канд. мед. наук:14.00.36 /Годков Михаил Андреевич.- М., 1998.- 25с.

16.Грачева, Т.А. Совершенствование хемилюминесцентного метода исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток/Т.А. Грачева //

Клин. лаб. диагностика. – 2008. - №2. – С.54-55.

17.Грачева, Т.А. Способ диагностики специфической сенсибилизации организма человека к бактериальным антигенам по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов / Т.А. Грачева // Иммунология. - 2007.-

Т.28. - №5. - С.297–299.