диссертации / 10

31

оценки физиологического состояния пациента (температура тела, частота пульса,

частота дыхания, лейкоцитоз, уровень СРП и т.д.). Наиболее популярные из них системы Ranson, IMRIE, APACHE II, SAPS 2, MODS, SOFA [44; 113]. Данные системы позволяют оценить выраженность синдрома системной воспалительной реакции и степень полиорганной недостаточности. Они обеспечивают приемле-

мую точность (около 80%), но информативны только через 48 ч после начала за-

болевания [84]. По мнению некоторых исследователей масштаб поражения под-

желудочной железы при асептическом панкреонекрозе коррелирует с выражен-

ностью синдрома полиорганной недостаточности [136]. В то время как, при ин-

фицированном течении ОДП полиорганные нарушения выражены в большей сте-

пени. Поэтому использование данных систем тоже возможно для прогнозирова-

ния гнойно-септических осложнений при ОДП.

Подводя итоги, надо сказать, что многочисленные инструментальные и кли-

нико-лабораторные методы прогнозирования позволяют оценивать масштаб по-

ражения поджелудочной железы, вовлечение в воспалительный процесс других органов и тканей, степень полиорганной недостаточности, выраженность систем-

ной воспалительной реакции и тяжесть течения ОДП. Однако ни одна из пере-

численных выше малоинвазивных методик не дает возможности прогнозировать наличие бактериального агента в очаге панкреатогенной деструкции на ранних стадиях заболевания.

1.3. Механизмы регуляции кислородозависимого метаболизма полиморфно-

ядерных лейкоцитов

Активация ПМЛ включает в себя следующие процессы: усиление адгезии,

хемотаксиса клеток в системном кровотоке, миграция клеток в очаг воспаления,

изменение их бактерицидной активности, которая сопровождается секрецией АФК и дегрануляцией секреторных гранул ПМЛ, а также продукция ими веществ

(цитокинов), способных участвовать в регуляции межклеточных взаимодействий при воспалении [46; 87]. Следовательно, критериев активированного состояния

32

ПМЛ может быть много и одним из них является изменение кислородозависимого метаболизма клетки, проявляющегося респираторным взрывом и секреций АФК

[50].

Респираторный, или кислородный взрыв, - это процесс образования продук-

тов частичного восстановления кислорода, свободных радикалов кислорода (су-

пероксид анион радикала (O2ˉ); гидроксильный радикал (OH˚); синглетный ки-

слород (1O2), гидроперекиси (Н2О2), гипохлорита (OClˉ) и других продуктов, об-

ладающих высокой токсичностью и, следовательно, мощной антимикробной ак-

тивностью [40]. Запуск респираторного взрыва в ПМЛ происходит при связыва-

нии стимулирующего фактора с поверхностью клетки (через определенные ре-

цепторы или при непосредственном взаимодействии с мембраной клетки) с по-

следующей активацией связанных с плазматической мембраной ферментов – мембранных оксидаз [113]. Активация мембранных оксидаз приводит к увеличе-

нию потребления кислорода и окислению глюкозы через гексозомонофосфатный шунт с образованием НАДФН [86]. Далее после непродолжительного лаг-

периода (до одной минуты) происходит активация мембранного комплекса -

НАДФН-оксидазы, что проявляется в сборке ее субъединиц с участием фосфоли-

пазы С и системы киназ, включая протеинкиназу С [50]. Это приводит к усилению окисления НАДФН НАДФН-оксидазным комплексом с образованием суперок-

сид анион радикала, который спонтанно или в присутствии супероксиддисмутазы

(СОД) дисмутирует в Н2О2 и синглетный кислород. Одновременно с данным процессом происходит дегрануляция ПМЛ с высвобождением еще одной мощной ферментной системы, участвующей в респираторном взрыве - миелопероксидазы

(МПО). МПО в присутствии ионов хлора продуцирует из Н2О2 гипохлорит [72].

В присутствии металлов (ионов Fe2+) Н2О2 дает начало образованию гидроксиль-

ного радикала (OH˚) путем вступления в реакцию Фентона [40]. В отсутствии данных ионов реакция разложения Н2О2 протекает с меньшей скоростью (в реак-

ции Хабера-Вейса) и также способствует образованию OH˚. Для предотвращения повреждения собственных клеток и тканей от накопления данных АФК, цитоток-

33

сичных не только для микроорганизмов, в клетке существуют механизмы их инактивации путем превращения в Н2О и кислород с участием СОД и каталазы

[11]. Рассмотренные выше свободно-радикальные процессы развиваются мол-

ниеносно, в течение нескольких секунд, что определяет их название - «взрыв».

Респираторный взрыв вызывают многие стимулирующие факторы. Это могут быть специфические антигенные препараты, различные химические стимулы

(кристаллы сульфата бария, частицы асбеста и пр.) и даже опсонизированные бак-

териальные компоненты – ЛПС [10; 25; 116; 129]. При действии различных сти-

мулов может проявляться определенное своеобразие, проявляющееся в различной выраженности отдельных составляющих каскада реакций, участвующих в респи-

раторном взрыве. Таким образом, при использовании различных стимулов воз-

можна определенная регуляция кислородозависимого метаболизма ПМЛ [35].

Известно, что регуляция функциональной активности ПМЛ может быть как положительной, так и отрицательной, поэтому ее принято подразделять на два вида – это «Up – регуляция» (положительная регуляция) и «Down – регуляция»

(отрицательная регуляция) [35]. При положительной регуляции происходит акти-

вация синтеза белка в ПМЛ, что в дальнейшем, может проявляться усилением эффекторного потенциала клетки (увеличением секреции АФК), например, при воспалительных реакциях. При отрицательной регуляции, наоборот, происходит угнетение функциональной активности ПМЛ, например, при воздействии бакте-

риальных токсинов или лекарственных веществ (глюкокортикоидов или нестеро-

идных противовоспалительных средств) [50]. Также известно, что функциональ-

ная активность ПМЛ зависит от предобработки их небольшим количеством сти-

мулирующего фактора in vivo или in vitro. При этом не происходит непосредст-

венной активации ПМЛ, а осуществляется переход клетки в состояние повы-

шенной функциональной готовности, и при последующем добавлении этого же или иного стимулятора интенсивность ответа возрастает [35; 82]. Данное явление было открыто McPhail J.M. и соавт. (1984) и получило название прайминг (priming), или предстимуляция [132]. Факторы, способные вызывать прайминг ПМЛ,

34

называют праймирующими или предстимулирующими. Прайминг принято отно-

сить к положительной регуляции активности ПМЛ. В настоящее время установ-

лено два типа прайминга [35]:

1.Кратковременная предстимуляция (время предстимуляции от нескольких ми-

нут до нескольких часов). Данный тип прайминга достигается большинством используемых стимулирующих факторов и приводит к двух-четырехкратному увеличению функциональных параметров ПМЛ. Вызывается низкими концен-

трациями праймирующих факторов. Важным механизмом данного типа прай-

минга является внутриклеточное увеличение концентрации ионов кальция.

2.Долговременная предстимуляция (время предстимуляции от нескольких часов до нескольких суток). Такой тип прайминга может быть вызван ограниченным числом стимулирующих факторов. В основном характерен для макрофагов.

Характеризуется десятикратным увеличением функциональных параметров клетки.

Молекулярные механизмы прайминга изучаются уже более 20 лет. Извест-

но, что одним из них является преобразование процесса передачи сигнала при взаимодействии праймирующего фактора с поверхностным мембранным рецеп-

тором ПМЛ на внутриклеточные ферментативные системы с последующей их ак-

тивацией. Примером может служить частичная сборка субъединиц НАДФН-

оксидазы (частичное фосфорилирование) при праймировании ПМЛ бактериаль-

ным ЛПС, Г-КСФ и др., которая сопровождается повышенной экспрессией цито-

хрома b558 [122; 134]. При последующей стимуляции происходит активация ПМЛ, «досборка» субъединиц НАДФН-оксидазы и развитие респираторного взрыва, что проявляется выработкой О2ˉ. Еще одним молекулярным механизмом прайминга является увеличение экспрессии и аффинности поверхностных рецеп-

торных структур в ответ на действие праймирующим фактором [35]. В исследова-

нии фенотипа поверхностных рецепторов ПМЛ при праймирующем влиянии ма-

лых доз ЛПС Нестеровой И.В. и соавт. (2010) была зафиксирована экспрессия та-

35

ких поверхностных рецепторов как СD11b, CD14, CD15,CD16, CD17, CD18, CD 24, CD25, CD 50, CD95 у доноров [83].

На сегодняшний день проведено немало исследований праймирующего влияния различных факторов на кислородозависимый метаболизм ПМЛ у здоро-

вых людей и животных. Среди праймирующих факторов можно выделить хемо-

таксические факторы, препараты про- и противовоспалительных цитокинов, им-

мунорегуляторные соединения, различные физические и химические факторы.

[23; 54; 56; 64; 82; 153]. Проводилось много исследований по изучению прайми-

рующих влияний бактерий или их отдельных компонентов. Так Marsha A. (1999)

исследовал феномен респираторного взрыва в клетках и бесклеточной системе при воздействии протеина А клеточной стенки Staphylococcus aureus. В данном исследовании было показано, что дозозависимое увеличение опосредованного протеином А генерирования АФК наблюдается в покоящихся и стимулированных форбол-миристат ацетатом (ФМА) ПМЛ доноров. Причем при изучении меха-

низма праймирующего влияния этого АГ Staphylococcus aureus на кислородозави-

симый метаболизм ПМЛ, выяснили, что протеин А вызывает активацию НАДФН-

оксидазы ПМЛ [131]. Аналогичным образом исследовали праймирующее влия-

ние антифагоцитарного фактора лейкоцидина Pseudomonas aeruginosa на секре-

цию АФК стимулированных зимозаном или ФМА кроличьих ПМЛ. Данное ис-

следование выявило усиление кислородозависимого метаболизма клеток (наличие эффекта прайминга) в ответ на предварительную стимуляцию лейкоцидином ПМЛ, причем засчет активации МПО [124]. Увеличение секреции АФК также происходит при праймирующем воздействии на ПМЛ гликолипидами микобакте-

рий или бактериальных ЛПС [91; 116].

Ранее в литературе были описаны случаи изучения праймирующего воздей-

ствия бактерий или их АГ на кислородзависимый метаболизм ПМЛ крови при различных инфекционных и воспалительных заболеваниях. Так Zabuska K. et al.

изучали особенности секреции АФК ПМЛ крови пациентов с туберкулезом в от-

вет на предстимуляцию бациллой Кальметта-Герена. В результате исследований

36

было показано, что уровень секреции АФК у пациентов выше, чем у здоровых доноров [152]. Аналогичные исследования проводились у пациентов с малярией.

Активация кислородозависимого метаболизма в ПМЛ, праймированных опсони-

зированными мерозоитами Plasmodium falciparum, в большей степени происходи-

ла у пациентов в момент приступа по сравнению со здоровыми донорами [130]. С

применением хемилюминесцентного анализа в присутствии латекса, стафилокок-

кового реагента, содержащего протеин А и убитой культуры Streptococcus группы А исследовали праймирующую способность ПМЛ крови больных с рожистым воспалением. Выявлялось увеличение секреции АФК ПМЛ в ответ на влияние стафилококкового реагента и убитой культуры Streptococcus группы А [41]. В на-

стоящее время изучение праймирующих влияний бактерий и их компонентов на ПМЛ также не теряет своей актуальности, поскольку открывает новые возмож-

ности для понимания роли ПМЛ в патогенезе исследуемых заболеваний, для профилактики и прогнозирования заболеваний и их осложнений [17].

Таким образом, изучение способности ПМЛ к праймингу in vitro имеет па-

тофизиологическое значение in vivo, поскольку является одним из механизмов ре-

гуляции гомеостаза и обеспечивает адекватную реализацию клеточных функций.

Между тем, процессы прайминга ПМЛ при ОДП остаются до сих пор неизучен-

ными.

1.4.Методы исследования кислородозависимого метаболизма ПМЛ

Всвязи с тем, что активация ПМЛ сопровождается резким усилением по-

требления кислорода, а также продукцией ряда медиаторов, секрецией АФК и ферментов существует несколько подходов к исследованию функциональной ак-

тивности данных клеток. На сегодняшний день существует ряд требований, кото-

рым должна соответствовать методика, исследующая клеточную продукцию АФК:

1.Специфичность для каждого отдельного радикала кислорода;

2.Высокая чувствительность;

37

3.Отсутствие влияния на функционирование самой клетки;

4.Способность к локализации места генерирования АФК;

5.Не должна требовать дорогостоящего и сложного в управлении лаборатор-

ного оборудования;

6. Легкая стандартизация.

Большинство существующих методов, не удовлетворяют всем этим критери-

ям. Недостатки различных методов отличаются и, поэтому, чтобы для клинически направленных исследований в полной мере оценить все процессы кислородозави-

симого метаболизма ПМЛ иногда используют несколько методик (таблицы 1, 2) [113].

В частности, в качестве метода определения образования АФК во время ды-

хательного взрыва используется НСТ-тест, который позволяет достоверно оце-

нить фагоцитарную активность ПМЛ [20]. Установлено, что процесс восстанов-

ления НСТ до темно-синего формазана коррелирует с внутриклеточным образо-

ванием перекиси водорода, которое, как показано, осуществляется при участии ферментной системы НАДФН - оксидазы. НСТ-тест получил широкое распро-

странение в клинической практике благодаря высокой чувствительности и про-

стоте воспроизведения. Тест используется также при постановке дифференциаль-

ного диагноза при вирусных и бактериальных инфекциях. Однако, существуют и минусы этого метода: визуальный подсчет НСТ-позитивных фагоцитов весьма субъективен, а методологические особенности его проведения требуют выделения популяции ПМЛ, что может изменять их функциональную активность.

38

Таблица 1.

Методы, используемые для измерения внеклеточной продукции АФК

(по Dahlgren C., Karlsson A., 1999)

39

Таблица 2.

Методы, используемые для измерения внутриклеточной продукции АФК

(по Dahlgren C., Karlsson A., 1999)

Кроме того, для определения АФК возможно применение спектрофотомет-

рического метода [56]. С помощью этого метода можно определить наличие ци-

40

тохрома b558 (главного компонента НАДФН-оксидазы) в изолированных мембра-

нах ПМЛ (спектр цитохрома b558). Для обнаружения гидроксильных радикалов,

наряду с ЭПР - спектроскопией, применяется газовая хроматография [24]. Также используют метод иммуноблотинга компонентов НАДФН-оксидазы в изолиро-

ванных мембране и цитозоле ПМЛ. В основе этого лежит исследование Western

блота с использованием специфических антительных компонентов [24; 35]. Метод является очень точным и применяется при диагностике хронической гранулома-

тозной болезни с дефицитом компонентов НАДФН-оксидазы gp 91-phox, p 22phox, p 47phox, p 67phox [24].

Известен также такой метод исследования кислородозависимого метаболиз-

ма ПМЛ как иодинация: ковалентное связывание радиоактивного иодила с про-

теином фагосом ПМЛ. Данным методом исследуется активность МПО в присут-

ствии Н2О2. Используется при диагностике хронической грануломатозной болез-

ни и при дефиците МПО. Существует фотометрическое определение О2ˉ методом СОД ингибирующего окисления цитохрома С АФК, вырабатываемыми активи-

рованными фагоцитами. Флуорометрический метод пероксидазозависимого окис-

ления РНРА используется для обнаружения Н2О2 [8].

Широкое распространение в экспериментальных и клинических исследова-

ниях получил хемилюминесцентный анализ [33; 37; 85]. Достоинствами этого ме-

тода являются простота и экспрессность, возможность получения бесконтактной информации о нативном состоянии, функционировании и метаболизме фагоци-

тирующих клеток, тканей, биологических жидкостей без необратимой их дест-

рукции, возможность регистрации клеточной активации по ходу ее развития,

чрезвычайно высокая чувствительность, позволяющая регистрировать микроко-

личества биологически активных веществ, неопределяемые другими методиками,

а также исключение субъективного фактора работы исследователя [15; 37; 38].

Таким образом, многообразие рассмотренных методов и методик проведе-

ния исследования кислородозависимого метаболизма ПМЛ, наличие положитель-

ных и отрицательных характеристик данных методов позволяет исследователю