диссертации / 10

41

выбрать наиболее приемлемый метод исследования и открывает возможность по-

иска раннего и специфического маркера для диагностики и прогнозирования мно-

гих заболеваний, протекающих с вовлечением в патогенетические механизмы развития заболевания фагоцитарного звена иммунитета.

1.5. Заключение по обзору литературы

Анализ данных проведенного обзора литературы показывает, что к настоя-

щему времени не существует единого мнения исследователей по целому ряду ключевых аспектов ОДП. Роль ПМЛ в патогенезе ОДП полностью не изучена

[34]. Остаются неисследованными механизмы прайминга ПМЛ крови при ОДП.

Не подтверждены предположения о возможной предстимуляции ПМЛ еще в сис-

темном кровотоке участвующими в транслокации бактериями и их продуктами жизнедеятельности и гипотеза о гиперстимуляции ПМЛ.

На практике самые большие разногласия вызывают диагностика и прогнози-

рование тяжести и формы течения, осложнений ОДП, а также тактика лечения таких пациентов. Многими исследователями подтвержден тот факт, что прогно-

зирование течения ОДП на начальной стадии заболевания и даже на момент по-

ступления пациента в стационар ведет к снижению летальных исходов из-за свое-

временно принятых мер комплексного интенсивного лечения [20; 31; 66; 84]. По-

иск новых ранних способов прогнозирования ОДП возможен при дальнейшем изучении патогенетических механизмов данного заболевания.

42

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служила цельная венозная кровь человека и ПМЛ, выделенные из венозной крови человека. Забор крови производился на основании полученного информированного согласия, из локтевой вены, в качестве антикоагулянта применялся раствор гепарина. Взятие крови у здоровых доноров-

добровольцев осуществлялось натощак рано утром. Критерием исключения из исследования среди доноров служило наличие в анамнезе аллергических, острых воспалительных и инфекционных заболеваний. Забор крови у больных с ОДП осуществлялся при поступлении в хирургическое отделение городской клинической больницы №55 г. Москвы до проведения хирургического вмешательства (1-е сутки стационарного лечения), а также в динамике данного заболевания -

на 3- е, на 7- е и на 14- е сутки от момента госпитализации больного. Критерием исключения из исследования среди пациентов с ОДП служило наличие в анамнезе аллергических заболеваний инфекционной этиологии, а также онкологических заболеваний и других сопутствующих заболеваний, влияющих на фагоцитарное звено иммунитета. С помощью хемилюминесцентного метода было обследовано 58 доноров и 28 пациентов с ОДП (таблицы 3 и 4). В динамике развития заболевания также были обследованы 28 пациентов, которые по ходу исследования в результате анализа и обработки полученных данных были разделены на 2 группы: 1-ая группа – с асептическим течением воспалительного процесса в поджелудочной железе, 2-ая группа – с инфицированным течением (с различными гнойно-деструктивными формами панкреонекроза).

43

Таблица 3.

Общая характеристика доноров-добровольцев, включенных в исследование

Количество человек

Таблица 4.

Общая характеристика больных, включенных в хемилюминесцентное

исследование

44

2.1. Клиническая характеристика пациентов с острыми деструктивными

панкреатитами

Диагноз острого панкреатита ставился пациентам при поступлении в приемное отделение больницы. Всем пациентам проводилась консервативная терапия острого панкреатита, согласующаяся с приказом №320 от 13.04.2011 Департамента Здравоохранения г. Москвы [65]. Степень тяжести заболевания определяли как тяжелую и среднетяжелую (по шкале APACHE II). Дифференцировку асептического и инфицированного течения воспалительного процесса при ОДП производили по результатам общей оценки клинической картины, динамики изменения лабораторных показателей крови, данных инструментальных методов и бактериологического исследования материала, полученного при лапараскопическом вмешательстве, проводимом в случае возникающих осложнений ОДП после 10-14

суток стационарного лечения. Во 2 группе пациентов при бактериологическом исследовании обнаруживалась грамотрицательная флора - Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniaе и грамположительная флора - Staphylococcus aureus, Enterococcus faecales.

Выбор суток исследования у пациентов с данным заболеванием связан с наличием в развитии ОДП 3-х периодов течения:

Ι период: 1-ые – 3-и сутки. Период патогенной токсемии (характеризуется активной продукцией провоспалительных цитокинов - «цитокиновый шторм», повышенной секрецией АФК).

ΙΙ период: 3-е – 14 -е сутки. Период эндогенной интоксикации, который сопровождается выработкой недоокисленных продуктов метаболизма в условиях гипоксии. Данный период заканчивается либо выздоровлением, либо переходит в следующий период.

ΙΙΙ период: 14-е – 17-е сутки. Период развития гнойно-септических ослож-

нений [74].

Увсех пациентов 1 группы улучшение клинической картины наступало, начиная с 10–14-х суток стационарного лечения. Во 2 группе пациентов наблюда-

45

лось усугубление клинической картины в динамике заболевания и к концу второй

недели развивались гнойные осложнения.

2. 2. Используемые материалы

1.Комплексные антигены бактериальные, стандартизированные по количеству микробных клеток в 1 мл суспензии (1∙109 микр.кл / мл). Производство Россия,

ГБОУ ВПО Российский Национальный Исследовательский Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, кафедра микробиологии и вирусологии педиатрического факультета.

Комплексный АГ Escherichia coli;

Комплексный АГ Klebsiella pneumoniae;

Комплексный АГ Staphylococcus aureus

Комплексный АГ Pseudomonas aeruginosa.

2.Гепарин (АО «Белмедпрепараты»), 20-50 ЕД/мл венозной крови.

3.Люминол (Sigma, США). Рабочая концентрация раствора равна 2×10 –3 М (С= 0,36 мг/ мл). Готовится раствор на фосфатном буфере (рН=7,35-7,45) с добав-

лением небольшого количества едкого натра (1 каплю 0,1 н NaOH), для улуч-

шения растворения. Раствор фильтруется и доводится соляной кислотой до рН=7,3-7,4. Готовый раствор разливают по эпиндорфам и замораживают при –

18С˚.

4.Люцигенин (Sigma, США). Рабочая концентрация раствора 2×10–3 М (С=0,1 мг

/мл). Раствор готовится на физиологическом растворе. Готовый раствор раз-

ливают по эппиндорфам и замораживают при температуре –18˚С.

5.Ледяная уксусная кислота (ЛУК), 90% (РЕАХИМ, Ереванский завод химреак-

тивов). Разводят сильно концентрированную уксусную кислоту дистиллиро-

ванной водой до концентрации 3%.

6.Среда Хенкса (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени М. П. Чумакова, Московская область). рН=7,35-7,45.

46

7.Сульфат бария. Рабочая концентрация раствора 2 мг/мл. Готовят непосредственно в день эксперимента из двух маточных растворов - сульфата натрия

(Na2SO4) и хлорида бария (BaCL2), в соотношении 1:1. Маточные растворы хранятся в холодильнике в течение месяца.

BaCL2: готовится на дистиллированной воде, С= 3,64 мг/мл.

Na2SO4: готовится на физиологическом растворе, С=2,43 мг/мл.

8.Краситель трипановый синий, концентрация раствора 0,1%, готовится матричный раствор на фосфатном буфере.

9.Фенол, раствор 0,25%.

10.Физиологический раствор изотонический 0,9%, используется для приготовления основных реактивов.

11.Формалин, раствор 37%.

12.Фосфатный буфер (РВS / К+), рН=7,45. Состоит из 2,68 мМ КСL 137,74 мМ NaCL, 1,5 мМ KH2PO4 и 8,09 мМ Na2HO4. Навески этих солей разводятся дистиллированной водой и смешиваются.

2.3.Методы

2.3.1.Метод приготовления бактериальных комплексных антигенов на

целлофановом диске

Комплексные АГ бактерий Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aerginosa были изготовлены из штаммов бактерий клинических изолятов на кафедре теоретической и экспериментальной микробиологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ при содействии профессора, д.м.н. Ефимова Б.А.

Основу метода составил «Способ получения бактериальных аллергенов», рег. Госреестр изобретений РФ 27.06. 2002 г. Патент № 218370. Заявка № 2001102725 от 31.01.2001, Федосеевой В.Н., Камышевой В.А [79].

Изолированные культуры микроорганизмов культивируют на стерильном целлофаном диске в чашке Петри (в модификации метода возможно культивиро-

47

вание микроорганизмов на стерильной твердой среде – кровяном агаре, в зависи-

мости от вида и свойств бактерии). С целлофанового диска или твердой среды культуры смывают физиологическим раствором. По Колмеру используется вся культура вместе с экзогенными продуктами жизнедеятельности бактерий. Живые взвеси бактерий разводят разводящей жидкостью до 1∙109 микробных клеток в

1мл суспензии. Далее культуры осторожно инактивируют парами 33% раствора формалина в течение 5 дней. После инкубации в термостате при 37°С через 2 дня проводят проверку на стерильность [1]. В модификации метода возможно опреде-

ление числа бактерий и доведение до нужной концентрации уже в стерильной суспензии микроорганизмов. Для измерения концентрации взвеси определяют плотность суспензии, в соответствии со стандартом мутности. Если полученные маточные суспензии не содержат антисептика, то к ним добавляют 0,25-0,5% фе-

нол.

Таким образом, полученные маточные суспензии состоят из инактивирован-

ных цельных микроорганизмов, их разрушенных компонентов (фрагменты кле-

точной стенки и др.), токсинов, ферментов и выделенных ими продуктов жизне-

деятельности и в полной мере обладают комплексными антигенными свойства-

ми.

антигенов

Маточные суспензии бактериальных антигенов содержат 1∙109 микробных клеток в 1 мл (микр.кл/мл). Для экспериментов готовятся следующие разведения данных маточных суспензий комплексов антигенов: см. таблицу 5, рисунок 3.

48

Таблица 5.

Концентрации бактериальных комплексных антигенов, использованных в

исследовании

Выделение ПМЛ осуществляли по методу Воуm А. [107]. Пробы крови от-

стаивали 2 часа при комнатной температуре для спонтанного осаждения эритро-

цитов. При этом большая часть лейкоцитов оставалась в плазме, которую собира-

ли в центрифужную пробирку и наслаивали на смесь фикола ("Sigma", USA) и

уротраста с удельной плотностью 1,077 г/см3.

50

Пробы центрифугировали на центрифуге ОПН-3 (ОПН-3, РФ) в течение 20

мин при 400g. Последовательно удаляя надосадочные фракции, получали осадок,

содержащий ПМЛ. Клетки ресуспензировали в 1 мл растворе фосфатного буфера состава: 137,74 мМ NaCl; 1,5 мМ NaН2Р04; 8,09 мМ Na2HP04 (pH=7,45), доводили объем суспензии в пробирке до 10 мл фосфатным буфером и центрифугировали при 200g в течение 15 мин, удаляя после центрифугирования образовавшийся су-

пернатант. Процедуру отмывки повторяли дважды с использованием того же бу-

фера. Полученный при конечном центрифугировании осадок ресуспензировали в растворе Хенкса. Клеточная суспензия содержала 94-95% ПМЛ, менее 1% лим-

фоцитов, 4-5% эритроцитов.

Для получения чистой фракции ПМЛ примесь эритроцитов удаляли путем гемолиза, который проводили следующим образом: осадок после градиентного разделения клеток, ресуспензировали в 0,5 мл дистиллированной воды в течение

10 секунд с последующим разведением в 20 раз фосфатным буфером и центрифу-

гированием при 200g в течение 15 мин.

Подсчет количества клеток в суспензии проводили под световым микроско-

пом, используя камеру Горяева, которую заполняли взвесью фиксированных 3%

ледяной уксусной кислотой клеток [14].

2.3.4. Метод подсчета полиморфно-ядерных лейкоцитов цельной крови

или выделенной суспензии в камере Горяева

В эппиндорфе смешивают 20 мкл цельной гепаринизированной крови или выделенной суспензии лейкоцитов с 380 мкл 3% раствора ЛУК (разведение 1:20),

подкрашенной несколькими каплями трипанового синего для окраски ядер ПМЛ.

Тщательно ресуспензируют и заполняют 2 сетки камеры Горяева. Производят подсчет ПМЛ в 25 окнах каждой сетки.

Среднее количество клеток в 25 окнах вычисляют по формуле (1):