диссертации / 10

51

где Х – среднее количество клеток в 25 окнах; Х1 количество клеток в 25 окнах

1 сетки; Х2 количество клеток в 25 окнах 2 сетки.

Количество клеток в 1мл вычисляют по формуле (2):

где N – количество клеток в 1мл; Х – среднее количество клеток в 25 окнах; Р

разведение (в данном случае равно 20).

2.3.5. Метод учета жизнеспособности полиморфно-ядерных лейкоцитов

Каплю крови или суспензии ПМЛ, разведенной в 20 раз 3% раствором ЛУК помещают на предметное стекло, добавляют каплю 0,1 % раствора красителя три-

панового синего, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Накрывают покровным стеклом и под световым микро-

скопом подсчитывают количество окрашенных ПМЛ в расчете на 100 поли-

морфно-ядерных клеток крови. Жизнеспособность вычисляют как процентное со-

отношение неразрушенных клеток к 100 клеткам препарата. Этот показатель дол-

жен составлять не менее 80-90%.

2.3.6. Определение суммарной секреции активных форм кислорода

полиморфно-ядерными лейкоцитами методом люминол-зависимой

хемилюминесценции

Для измерения люминол-зависимой хемилюминесценции (Л-ХЛ) исследуе-

мых образцов цельной разведенной крови или суспензии ПМЛ доноров и больных в работе был использован биохемилюминесцентный анализатор BLM- 3606М-01

(СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия, г. Красноярск) с программным обеспече-

нием BLM Obrab для регистрации и обработки сигнала хемилюминесценции на персональном компьютере.

Отбирали объемы крови или суспензии клеток, содержащие 1×106 ПМЛ, к

ним добавляли 0,6 мл раствора Хенкса (конечный объем проб составлял 0,7 мл).

Затем образцы помещали в измерительные кюветы анализатора, проводили за-

52

пись собственной интенсивности излучения крови или суспензии ПМЛ, потом в пробы вводили 0,15 мл усилителя ХЛ – люминола (маркера образования многих АФК: О2ˉ, Н2О2, ОН˚ и/или СlOˉ) [12; 93] и в течение 2-3 мин регистрировали спонтанную хемилюминесценцию. После этого в кюветы добавляли 0,15 мл стимулятора свечения – сульфата бария и проводили запись стимулированной Л-

ХЛ. Пример регистрации кривой Л-ХЛ показан на рисунке 4. Измерение Л-ХЛ исследуемых образцов проводили в режиме постоянного перемешивания при температуре 37˚С.

Рис.4. Регистрируемые параметры кривой люминол-зависимой хемилюминесценции.

С помощью компьютерной программы BLMObrab определяли следующие регистрируемые параметры ХЛ:

интенсивность спонтанной хемилюминесценции Iспонт;

интенсивность максимальной хемилюминесценции Iмах, которая отражает скорость реакции;

53

время достижения максимальной вспышки хемилюминесценции Тмах, ха-

рактеризующее опсоническую активность сыворотки;

интенсивность стимулированной хемилюминесценции Iстим, отражающая скорость реакции клеток на действие стимула, вычисляемая по формуле (3):

(3);

площадь под кривой хемилюминесценции Sхл, отражающей светосумму ХЛ за время регистрации свечения.

2.3.7. Определение секреции супероксид анион радикала кислорода

полиморфно-ядерными лейкоцитами методом люцигенин-зависимой

хемилюминесценции

Для определения секреции супероксид анион радикала кислорода (О2ˉ) ПМЛ применяют различные методики, связанные с люминесценцией. Примером может служить пероксидаза-зависимая-люминол-усиленная хемилюминесценция (метод Л-ХЛ по Wymann M.P. et al., 1987) и люцигенин-зависимая хемилюминесценция

(Лц-ХЛ) [12; 110]. Метод Л-ХЛ по Wymann M.P. имеет свои недостатки - это косвенный метод определения количества образованной Н2О2 и требует наличия ингибитора МПО - азида натрия. В тоже время требуется наличие пероксидазы хрена, которая нечувствительна к высоким концентрациям азида и нейтрализует все АФК, кроме Н2О2.

Люминофор люцигенин избирательно связывается только с О2ˉ, который об-

разуется при активации НАДФН-оксидазы ПМЛ [2]. В ряде исследовательских работ показано, что в механизме генерации Лц-ХЛ стимулированными ПМЛ миелопероксидаза не принимает участия, а основной вклад вносит НАДФН - ок-

сидаза [12; 56]. В связи с этим в данной работе для определения активности НАДФН – оксидазы ПМЛ была использована методика Лц-ХЛ. Ее описание ана-

логично методике Л-ХЛ в п. 2.3.5., отличительной особенностью данного метода является использование в качестве активатора свечения - люцигенина. Зарегист-

54

рированная интенсивность Лц-ХЛ отражает количество О2ˉ, образовавшегося в результате активации НАДФН-оксидазы ПМЛ при воздействии стимула.

2.3.8. Определение влияния условий инкубации in vitro на ПМЛ

методами люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции

Для установления факта наличия или отсутствия эффекта прайминга ПМЛ крови при воздействии инкубации при 37˚С образцы крови или суспензии ПМЛ,

содержащие 1×106 клеток / мл предварительно инкубировали в течение 60 мин при 37º С в режиме постоянного перемешивания. Время инкубации при 37ºС бы-

ло выбрано согласно ряду ранее проведенных исследований по подбору опти-

мальных условий с различными специфическими факторами бактериальной при-

роды [52; 68]. Контрольные пробы не инкубировались. Конечный объем пробы составлял 0,7 мл. После инкубации по описанной выше методике (п.2.3.5.) произ-

водили измерение интенсивности хемилюминесценции. С помощью компьютер-

ной программы BLMObrab определяли регистрируемые параметры ХЛ, описан-

ные в пункте 2.3.6. Далее определяли вычисляемые параметры ХЛ - индекс сти-

муляции ИС по формуле (4) и индекс соотношения площадей под кривыми хе-

милюминесценции ИП по формуле (5):

где Iстим оп – интенсивность стимулированной хемилюминесценции предвари-

тельно проинкубированной пробы; Iстим к – интенсивность стимулированной хемилюминесценции пробы без инкубации.

где Sхл оп – площадь под кривой хемилюминесценции предварительно проинку-

бированной пробы; Sхл к – площадь под кривой хемилюминесценции пробы без инкубации.

Эффект прайминга проявляется в увеличении ответа ПМЛ на последую-

щую стимуляцию, определяемом в виде ИС и ИП (индексы должны достоверно

55

положительно коррелировать между собой и их значения должны превышать 1,0).

Одновременно с этим происходит сокращение лаг-периода и увеличение скоро-

сти развития ответа на последующую стимуляцию [133].

Оценку влияния компонентов крови (опсонинов и др.) при воздействии усло-

вий инкубации in vitro на секрецию АФК ПМЛ производили сравнением ИС, ИП

в сериях экспериментов на ПМЛ цельной крови и выделенных ПМЛ. В случае от-

сутствия сильной положительной корреляции данных параметров констатировали наличие влияния компонентов крови на механизмы клеточного прайминга.

бактериальных антигенов на ПМЛ методами люминол- и люцигенин-

зависимой хемилюминесценции

Для установления факта наличия или отсутствия эффекта прайминга ПМЛ крови при воздействии бактериальных комплексных АГ образцы крови или сус-

пензии ПМЛ, содержащие 1×106 клеток / мл предварительно инкубировали с 0,01

мл суспензии комплексного АГ Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus или Pseudomonas aeruginosa в различных разведениях, указанных в таблице 5, в течение 60 мин при 37ºС в режиме постоянного перемешивания.

Контрольные пробы вместо комплекса АГ бактерий содержали тот же объем фи-

зиологического раствора и также инкубировались. Конечный объем пробы со-

ставлял 0,7 мл. После инкубации по описанной выше методике (п.2.3.6.) произ-

водили измерение интенсивности хемилюминесценции. В качестве активаторов свечения использовали люминол и люцигенин, которые добавлялись в количестве

0,15 мл. В качестве стимулятора ХЛ добавляли 0,15 мл сульфата бария. С помо-

щью компьютерной программы BLMObrab определялись регистрируемые пара-

метры ХЛ, описанные в пункте 2.3.5. Далее вычисляли ИС по вышеописанной формуле (4), где Iстим оп – интенсивность стимулированной хемилюминесцен-

ции пробы, предварительно проинкубированной с комплексным антигеном;

Iстим к – интенсивность стимулированной хемилюминесценции контрольной

56

пробы. ИП вычисляли также по вышеописанной формуле (5), где Sхл оп – пло-

щадь под кривой хемилюминесценции пробы, предварительно проинкубирован-

ной с комплексным антигеном; Sхл к – площадь под кривой хемилюминесценции контрольной пробы.

Наличие эффекта прайминга у ПМЛ крови констатировали в случае, если показатели, характеризующие его, достоверно положительно коррелировали меж-

ду собой и превышали значение 1,0. Оценку влияния компонентов крови при воз-

действии бактериальными комплексными АГ на ПМЛ производили сравнением

ИС, ИП в сериях экспериментов на ПМЛ цельной крови и выделенных ПМЛ. В

случае отсутствия сильной положительной корреляции данных параметров гово-

рили о наличии влияния компонентов крови на механизмы клеточного прайминга.

2.3.10. Методы статистической обработки результатов

Статистический анализ экспериментальных данных заключался в расчете характеристик выборки, выборе метода оценки, проверки статистически значи-

мых отличий между сравниваемыми группами. Обработка данных производилась с использованием функциональных возможностей приложения Microsoft Office Excel 2010, и пакета прикладных программ «STATISTICA for Windows» версия

7.0 (StatSoft, USA).

При обработке результатов пользовались параметрическими и непараметри-

ческими статистическими методами. Результаты выражали как среднее арифме-

тическое (М) для анализируемой группы показателей ± стандартное отклонение

(M±m). Для индексов стимуляции ХЛ и индексов соотношения площадей под кривыми ХЛ определяли коэффициент корреляции (r). Для проверки получен-

ных данных нормальному закону распределения использовали критерий Колмо-

горова-Смирнова. В случае нормального распределения выборки использовали критерий Стьюдента и коэффициент корреляции Пирсона. Для малых n<30 и в случае ненормального распределения выборки пользовались тестом Манна-

Уитни. Различие средних показателей считалось достоверным при уровне значи-

мости менее 0,05 [43].

57

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение влияния условий инкубации in vitro на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме

Установлено, что изменения секреции АФК ПМЛ крови в норме могут про-

исходить под влиянием многочисленных специфических и неспецифических фак-

торов. Природа данных факторов может быть различна. Однако влияние не всех факторов изучено в полной мере. Мы предполагаем, что воздействие предвари-

тельной инкубации в течение 60 мин при 37˚С в условиях in vitro на ПМЛ может являться неспецифическим фактором, поскольку не требует наличия специфиче-

ских рецепторов на поверхности клетки для запуска дыхательного взрыва [35].

В тоже время наличие в цельной крови опсонинов и других ее компонентов также может способствовать данному влиянию инкубации при 37˚С на секрецию АФК ПМЛ. Для подтверждения праймирующего влияния условий in vitro на секрецию АФК ПМЛ крови доноров мы инкубировали образцы цельной разве-

денной крови в течение 60 минут при 37˚С. Жизнеспособность ПМЛ образцов крови практически не менялась и составляла более 95%. Далее были сопоставле-

ны результаты параметров ХЛ крови без инкубации и с инкубацией в течение 60

мин при 37˚С (таблица 6).

В очаге воспаления, как известно, происходит повышение температуры [36].

Это нужно для усиления опсонизирующей способности плазмы крови, для интен-

сификации метаболических процессов в клетках. Получены схожие результаты in vitro: оказалось, что в образцах крови после предварительной инкубации в тече-

ние 60 мин при температуре 37˚С параметры Л-ХЛ, характеризующие суммарную секрецию АФК ПМЛ увеличиваются в 2,8- 3,6 раза. Iстим увеличивается на

65,2% (р<0,05), а Sхл Л-ХЛ увеличивается на 177,4% (р<0,05). Тмах, характери-

зующее опсоническую активность плазмы крови увеличивается на 16,0% (р<0,05).

58

Таблица 6.

Регистрируемые параметры ХЛ ПМЛ крови и суспензии выделенных ПМЛ

доноров в условиях инкубации in vitro, (M±m)

Примечание. n=15. * - с p<0,05 отличаются при сравнении данных в группах «с инкубацией» и «без инкубации» относительно друг друга в столбцах «Выделенные ПМЛ» или «ПМЛ крови». # - с р<0,05 отличаются при сравнении данных «Выделенные ПМЛ» и «ПМЛ крови» в группах с инкубацией или без нее.

При исследовании секреции О2ˉ ПМЛ крови (Лц-ХЛ) Iстим увеличивается на 8,5% (р<0,05), а Sхл Лц-ХЛ - на 49,6% (р<0,05). Тмах увеличивается на 3,5%

(р<0,05). Необходимо отметить тот факт, что Iспонт при измерении Л-ХЛ и Лц-

ХЛ крови после инкубации при 37˚С значительно возрастают (на 257,9% и 184,3% соответственно (р<0,05), что свидетельствует о спонтанном выделении АФК еще в процессе инкубации экспериментальных образцов до измерения ХЛ.

Это объясняется тем, что в крови эритроциты могут передавать кислород лейко-

цитам, и при инкубации, как и при воспалении, эти процессы естественно уско-

ряются [13]. Мы также предполагаем, что и сами ПМЛ могут предстимули-

роваться в условиях in vitro. Для подтверждения этого предположения мы прове-

ли измерение ХЛ суспензий выделенных ПМЛ без инкубации и после предвари-

тельной инкубации при 37˚С в течение 60 минут. Жизнеспособность образцов суспензии выделенных ПМЛ практически не менялась и составляла более 94%.

Полученные результаты были сопоставлены с результатами серии экспериментов

59

на цельной крови (см. табл.6). Абсолютные величины регистрируемых парамет-

ров Л-ХЛ и Лц-ХЛ (кроме Тmax) ПМЛ крови значительно ниже, чем в суспензии выделенных клеток (см. табл.6 колонки «Без инкубации»). Присутствие в крови плазменных факторов способствует опсонизации стимулятора ХЛ – сульфата ба-

рия, что должно в большей степени стимулировать выделение АФК лейкоцитами и давать большую интенсивность излучения хемилюминесценции. Однако, эрит-

роциты, находящиеся в цельной разведенной крови, экранируют данное излуче-

ние лейкоцитов за счет содержания в них гемоглобина [80]. Этим и объясняется такая разница в абсолютных величинах при измерении ХЛ цельной разведенной крови и суспензии выделенных ПМЛ доноров.

При исследовании влияния условий in vitro (инкубации в течение 60 мин при

37˚С) на выделенные ПМЛ также наблюдается увеличение параметров ХЛ, что свидетельствует об увеличении секреции АФК ПМЛ. Однако данное увеличение не такое сильное, как в цельной крови: Sхл Л-ХЛ увеличивается на 6,2%

(р<0,05), Iстим - на 5,7% (р<0,05), Тmax - на 11,5% (р<0,05). Напротив, секреция О2ˉ выделенными ПМЛ возрастает сильнее, чем в цельной крови – Iстим увели-

чивается на 41,5 % (р<0,05), Sхл Лц-ХЛ - на 15,8% (р<0,05), Тmax - на 4,9% (р<0,05). Необходимо заметить, что Iспонт при измерении Л-ХЛ и Лц-ХЛ в сус-

пензии выделенных клеток при инкубации уменьшается (на 51,4 % и 28,6% соот-

ветственно (р<0,05). Это объясняется тем, что в суспензиях ПМЛ нет эритроци-

тов, и лейкоциты потребляют при инкубации только тот кислород, который рас-

творен в среде Хенкса, поэтому спонтанное выделение АФК ПМЛ уменьшается.

О праймирующем влиянии инкубации в течение 60 мин при 37˚С на секре-

цию АФК ПМЛ можно заключить и из результатов таблицы 7. Вычисляемые па-

раметры ХЛ, характеризующие праймирующее влияние инкубации в течение 60

мин при 37˚С на секрецию АФК - ИС и ИП >1,0 (р<0,05) как для выделенных ПМЛ, так и для ПМЛ крови. В цельной крови данные индексы изменяются в большей мере, чем соответствующие индексы у выделенных ПМЛ.

60

Таблица 7.

Сравнение индексов стимуляции и соотношения площадей под кривыми Л-ХЛ

иЛц-ХЛ суспензии выделенных ПМЛ и ПМЛ крови доноров

вусловиях инкубации in vitro, (M ± m)

Примечание. n=15.* - c p<0,05 отличается по сравнению с аналогичными показателями у ПМЛ крови.

Наличие других компонентов крови (опсонинов и пр.) положительно сказы-

вается на праймировании секреции АФК ПМЛ. Тогда как, процессы выделения клеток могут оказывать негативное влияние на способность ПМЛ секретировать АФК, то данные факты свидетельствуют о том, что для получения результатов максимально приближенных и неискажающих картину in vivo необходимо про-

водить исследование секреции АФК ПМЛ на цельной разведенной крови.

ИС и ИП выделенных ПМЛ в случае измерения Лц-ХЛ возрастают сильнее

(на 28,0% и 34,0% соответственно), чем при измерении Л-ХЛ (ИС возрастает на

7,0%, а ИП на 11,0%). Это подтверждает наше предположение о предстимули-

рующем влиянии инкубации в течение 60 мин при 37˚С на секрецию АФК ПМЛ и без наличия компонентов цельной крови, причем за счет увеличения секреции О2ˉ. Данный факт свидетельствует об основной роли НАДФН-оксидазы в меха-

низмах предстимуляции выделенных ПМЛ и о значительной роли в механизмах предстимуляции ПМЛ крови в условиях in vitro.

Таким образом, в таблице 6 и 7 представлены результаты, из которых можно заключить, что инкубация в течение 60 мин при 37˚С вызывает увеличение секре-

ции АФК ПМЛ. Праймирующее влияние инкубации в течение 60 мин при 37˚С на секрецию АФК ПМЛ происходит как в случае регистрации интенсивности Л-ХЛ,

так и при регистрации интенсивности Лц-ХЛ, и оно различно. Это свидетельству-