диссертации / 10

61

ет о неодинаковом влиянии инкубации в течение 60 мин при 37˚С на ферментные системы кислородозависимого метаболизма ПМЛ и роли компонентов цельной крови в данном праймирующем влиянии.

3.2. Изучение влияния условий инкубации in vitro на секрецию активных

форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови при остром

деструктивном панкреатите

При возникновении острого воспалительного процесса in vivo ПМЛ прихо-

дят в состояние предстимуляции еще в кровеносном русле, а мигрируя в очаг вос-

паления, реализуют там все свои эффекторные функции, в том числе и секрецию АФК. В одних случаях исход этого воспаления носит благоприятный характер:

процесс разрешается и наступает выздоровление, а в других могут развиваться гнойные и деструктивные осложнения. Одной из причин этого может быть избы-

точная или недостаточная секреция АФК ПМЛ. В случае избыточной секреции АФК могут возникать деструктивные осложнения воспалительного процесса, а

при недостатке АФК – возможно присоединение развивающегося гнойного ком-

понента. Для подтверждения данного предположения методом ХЛ нами были об-

следованы 2 группы пациентов с различным течением острого воспалительного процесса в поджелудочной железе. 1 группа пациентов имела асептическое тече-

ние ОДП, и в дальнейшем протекавшего без осложнений и сопровождавшегося клиническим выздоровлением, а 2 группа - с инфицированным течением и раз-

личными гнойно-септическими осложнениями ОДП.

Из результатов таблицы 8 следует, что в исследуемых группах пациентов уровень секреции АФК ПМЛ крови различен. Регистрируемые параметры Л-ХЛ,

характеризующие суммарную секрецию АФК ПМЛ крови (таблица 8, колонки

«без инкубации») в 1 группе достоверно превышают значения в группе доноров и во 2 группе пациентов. В 1 группе Iспонт увеличивается на 47,5% (р<0,05),

Iстим – на 78,0% (р<0,05), Sхл – на 275,5% (р<0,05) по сравнению с донорами. Во

2 группе Iспонт достоверно не отличается, а Iстим увеличена на 55,0% (р<0,05), а

62

Sхл – на 85,1% (р<0,05). Для Tmax в исследуемых группах достоверных отличий

с донорами найдено не было.

Примечание: * - с p<0,05 отличается от аналогичных показателей в группе доноров; # - с p<0,05 отличается от аналогичных показателей в 1 группе.

Регистрируемые параметры Лц-ХЛ ПМЛ крови (таблица 8, колонки «без ин-

кубации»), характеризующие секрецию О2ˉ в 1 группе также достоверно пре-

вышают значения в группе доноров и во 2 группе пациентов. В 1 группе Iспонт

увеличивается на 71,4% (р<0,05), Iстим - на 69,3 % (р<0,05), Sхл – на 28,8% (р<0,05), а Tmax снижается на 31,5% (р<0,05) по сравнению с донорами. В то же время во 2 группе регистрируемые параметры Лц-ХЛ наоборот снижаются по сравнению с донорами - Iспонт на 16,0% (р<0,05), Iстим на 34,0% (р<0,05), Sхл

– на 34,2% (р<0,05), а Tmax на 29,7% (р<0,05).

Таким образом, следует заключить, что при инфицированном течении воспа-

лительного процесса при ОДП наблюдается снижение секреции АФК ПМЛ, в т. ч.

и секреции О2ˉ по сравнению с асептическим течением ОДП (уровень суммарной секреции АФК снижен на 50,7% (p<0,05), а уровень секреции О2ˉ снижен на

48,9% (p<0,05).

63

При изучении влияния инкубации в течение 60 мин при 37˚C на суммарную

секрецию АФК ПМЛ крови пациентов с ОДП в обеих исследуемых группах так-

же получено увеличение регистрируемых параметров Л-ХЛ при сравнении с группой доноров, однако во 2 группе это увеличение незначительно. В 1 группе

личивается на 69,3% (р<0,05), Sхл - на 91,0% (р<0,05). Tmax в 1 группе снижается

на 31,5% (р<0,05). Во 2 группе I cтим снижается на 10,9% (р<0,05), а Tmax - на

5,8% (р<0,05).

Изменение уровня секреции АФК ПМЛ при различном течении ОДП, оцени-

ваемое по величине площади под кривой ХЛ продемонстрировано на рисунке 5 А

Рис. 5. Влияние инкубации на секрецию АФК ПМЛ крови при остром деструктивном панкреатите в условиях in vitro.

Примечание. А - суммарная секреция АФК ПМЛ, оцениваемая по величине площади под кривой Л-ХЛ, Б - секреция О2ˉ ПМЛ, оцениваемая по величине площади под кривой Лц-ХЛ.

64

Необходимо отметить, что величины Iспонт при измерении Л-ХЛ и Лц-ХЛ в обеих группах пациентов снижаются, что можно объяснить тем, что эритро-

циты при ОДП истощаются еще в кровеносном русле, так как в системном крово-

токе при ОДП наблюдаются гипоксия и метаболический ацидоз [63]. В связи с этим при инкубации в пробе (в условиях in vitro) эритроциты уже не способны поставлять кислород лейкоцитам для спонтанного выделения ими АФК.

При сравнении индексов, характеризующих праймирующее влияние инкуба-

ции в течение 60 мин при 37˚С на секрецию АФК ПМЛ доноров и больных ОДП было выявлено снижение данного влияния у всех пациентов (таблица 9). При сравнении ИС и ИП между собой для каждой из групп больных путем корреляци-

онного анализа нами также было выявлено, что данные индексы имеют сильную положительную корреляцию. Для 1 группы пациентов характерны более высокие значения ИС и ИП, характеризующие праймирующее влияние инкубации в тече-

ние 60 мин при 37˚С на секрецию АФК ПМЛ по сравнению со 2 группой. Сум-

марная секреция АФК ПМЛ под влиянием инкубации при 37˚С достоверно сни-

жена на 13,9-19,1%. Секреция О2ˉ ПМЛ крови, наоборот, увеличена на 51,0-58,1% (p<0,05) по сравнению с донорами. Во 2 группе суммарная секреция АФК ПМЛ под влиянием инкубации в течение 60 мин при 37˚С снижена на 47,1-49,4% (p<0,05), в т. ч. и секреция О2ˉ на 9,2-11,4% (p<0,05).

Таблица 9.

Сравнение индексов стимуляции и соотношения площадей под кривыми ХЛ ПМЛ крови больных ОДП в условиях инкубации in vitro, (M ± m)

Примечание: * - p<0,05 при сравнении с группой доноров, # - p<0,05 при сравнении с 1 группой.

65

Из полученных результатов можно заключить, что при инфицированном течении ОДП и под влиянием инкубации в течение 60 мин при 37˚С наблюдается снижение секреции АФК ПМЛ, в том числе и секреции О2ˉ.

Поскольку уровень секреции АФК в данных группах пациентов с ОДП раз-

личен, возникло предположение, что причиной этого, возможно, является при-

сутствие в крови пациентов с инфицированным течением ОДП специфических факторов, подавляющих секрецию АФК ПМЛ. Такими специфическими фактора-

ми могут быть бактерии и их АГ, участвующие в бактериальной транслокации из толстого кишечника при инфицировании очагов панкреодеструкции. По данным литературы наиболее часто высеваемыми возбудителями при инфицировании ОДП являются Escherichia coli, Klebsiella spp, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa [59; 120]. В макроорганизме бактерии при воспалении оказывают влияние на ПМЛ не одним каким-то своим компонентом, а целым комплексом факторов патогенности и инвазии. В связи с этим на следующем этапе данной ра-

боты были использованы комплексные бактериальные АГ, состоящие из инакти-

вированных цельных бактерий, их разрушенных компонентов и выделенных ими продуктов жизнедеятельности.

Для подтверждения нашего предположения о влиянии бактериальных ком-

плексных АГ на секрецию АФК ПМЛ при ОДП необходимо изучить влияние та-

ковых на секрецию АФК ПМЛ в норме.

3.3. Изучение влияния бактериальных комплексных антигенов на секрецию

активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в

норме

Проведено исследование ХЛ образцов цельной крови и суспензии выделен-

ных ПМЛ доноров, предстимулированных в течение 60 мин комплексными АГ бактерий в заданном диапазоне концентраций (5×104 - 1000×104 микр. кл/мл).

66

3.3.1. Праймирующее влияние комплексного антигена Escherichia coli на

секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами крови в норме

В таблице 10 показано влияние комплексного АГ E.coli на регистрируемые

параметры Л-ХЛ и Лц-ХЛ ПМЛ крови доноров. Наблюдается обратная дозовая зависимость регистрируемых параметров ХЛ (Iспонт, Iстим, Sхл) характеризую-

щих секрецию АФК ПМЛ крови доноров при воздействии данным комплексным

Примечание: n=15; *- p<0,05 контрольной пробы.

О праймирующем влиянии комплексного АГ E.coli на секрецию АФК ПМЛ крови можно заключить и из результатов таблицы 11. В ней показано влияние комплексного АГ E.coli на вычисляемые параметры Л-ХЛ и Лц-ХЛ ПМЛ крови доноров – ИС и ИП. Индексы, характеризующие праймирующее влияние на сек-

рецию АФК ПМЛ крови, положительно коррелируют между собой (r=0,96;

67

р<0,05 и r=0,93; р<0,05 соответственно). Также как и регистрируемые параметры ХЛ имеют обратную дозовую зависимость от концентрации комплексного АГ

E.coli.

Таблица 11.

Сравнение индексов стимуляции и соотношения площадей под кривыми ХЛ ПМЛ крови доноров, при воздействии комплексного АГ E.coli, (M ± m)

Примечание: n=15;*-p<0,05 относительно контрольной пробы.

Проанализировав полученные результаты из таблиц 10 и 11, можно резю-

мировать, что праймирующий эффект комплексного АГ E.coli. на суммарную секрецию АФК ПМЛ наблюдается в диапазоне концентраций 5×104 - 500×104

микр. кл/мл, на концентрации 5×104 микр. кл/мл - он наибольший. На самой большой концентрации, равной 1000×104 микр. кл/мл происходит достоверное угнетение суммарной секреции АФК ПМЛ крови доноров. Праймирующее влия-

ние на секрецию О2ˉ ПМЛ наблюдается в диапазоне концентраций 5×104 - 250×104

микр. кл/мл, на концентрации 25×104 микр. кл/мл - оно наибольшее. На концен-

трации 500×104 микр. кл/мл достоверного отличия от контроля получено не бы-

68

ло. Самая большая концентрация комплексного АГ, равная 1000×104 микр. кл/мл оказывает угнетающий эффект на секрецию О2ˉ ПМЛ доноров.

На рисунке 6 продемонстрировано, что более выраженное предстимули-

рующее действие комплексный АГ E.coli оказывает на суммарную секрецию АФК ПМЛ крови у доноров. Кривая зависимости ИП от концентрации данного ком-

плексного АГ при измерении Л-ХЛ располагается выше аналогичной кривой при измерении Лц-ХЛ.

Рис. 6. Сравнение индексов соотношения площадей под кривыми Л-ХЛ и Лц-ХЛ ПМЛ крови доноров при воздействии комплексного АГ E.coli. Примечание. *- р <0,05

относительно контроля; **- р <0,05 относительно аналогичной точки на кривой Лц-ХЛ.

В связи с тем, что роль опсонинов и других компонентов цельной крови в

процессах секреции АФК ПМЛ при взаимодействии с некоторыми микроорга-

низмами (например, со Staphylococcus aureus, в работах Невмятуллина А.Л., 1988 и Редькина А.П., 1989) ранее уже была доказана, исключить их влияния в механизмах прайминга при взаимодействии с исследуемыми бактериальными комплексными АГ не представлялось возможным без экспериментального тому подтверждения. Для того чтобы выяснить роль компонентов цельной крови в механизмах праймирующего влияния на секрецию АФК ПМЛ комплексного АГ

E.coli нами было проведено изучение влияния данного комплексного АГ на реги-

стрируемые и вычисляемые параметры Л-ХЛ и Лц-ХЛ суспензии выделенных

69

лейкоцитов крови доноров. Из результатов таблицы 12 видно, что при воздейст-

вии данного комплексного АГ на секрецию АФК выделенными ПМЛ также на-

блюдается обратная дозовая зависимость регистрируемых параметров ХЛ. Абсо-

лютные величины регистрируемых параметров ХЛ отличаются от таковых в цельной крови за счет экранирования ХЛ излучения присутствующими в цельной крови эритроцитами, но тенденция дозовой зависимости аналогична.

Таблица 12.

Регистрируемые параметры ХЛ суспензии выделенных ПМЛ крови доноров,

при воздействии комплексного АГ E.coli, (M ± m)

Примечание: n=15;*- p<0,05 относительно контрольной пробы.

При вычислении индексов, характеризующих праймирующее влияние на суммарную секрецию АФК и секрецию О2ˉ выделенными ПМЛ доноров (таблица

13) также как и в предыдущей серии экспериментов на цельной крови была полу-

чена обратная дозовая зависимость данных параметров при воздействии ком-

плексного АГ E.coli. Из таблицы 13 видно, что ИП, характеризующие прайми-

рующее влияние на суммарную секрецию АФК в цельной крови превышают зна-

чения ИП выделенных ПМЛ. С нашей точки зрения, это также подтверждает не-

гативное влияние выделения ПМЛ на секрецию АФК. В результате проведенного корреляционного анализа получена прямая взаимосвязь между ИП ПМЛ крови и ИП выделенных ПМЛ у доноров (r=0,93; р<0,05 в случае регистрации Л-ХЛ и

70

r=0,95; р<0,05 в случае регистрации Лц-ХЛ). Наибольший предстимулирующий эффект на суммарную секрецию АФК и секрецию О2ˉ выделенными ПМЛ на-

блюдается при воздействии самой низкой концентрацией комплексного АГ -

5×104 микр. кл/мл. Самая большая концентрация, равная 1000×104 микр. кл/мл на выделенных клетках дает достоверно угнетающий эффект на секрецию АФК как и на ПМЛ цельной крови.

Таблица 13.

Сравнение индексов соотношения площадей под кривыми ХЛ ПМЛ крови

и выделенных ПМЛ доноров, при воздействии комплексного АГ E.coli, (M ± m)

Примечание: n=15; *- p<0,05 относительно контрольной пробы.

Из данных результатов можно сделать вывод, что роль компонентов цельной крови в механизмах праймирующего влияния комплексного АГ E.coli на секре-

цию АФК ПМЛ у доноров незначительна.

3.3.2. Праймирующее влияние комплексного антигена Staphylococcus

aureus на секрецию активных форм кислорода полиморфно-ядерными

лейкоцитами крови в норме

В таблице 14 показано влияние комплексного АГ Staphylococcus aureus на регистрируемые параметры Л-ХЛ и Лц-ХЛ ПМЛ крови у доноров. Наблюдается обратная дозовая зависимость регистрируемых параметров ХЛ (Iспонт, Iстим,