районы.

С-окрашивание (от англ. Costitutive heterochromatin - конститутивный гетерохроматин) – выявляет вариабельные по величине темноокрашенные сегменты конститутивного гетерохроматина (сегменты прицентромерных участков всех хромосом, коротких плеч 13,14, 15,21,22 и длинного плеча У-

хромосомы).

Т-окрашивание – позволяет хорошо окрашивать теломерные области.

NOR - окрашивание (от англ. Nucleolar Organizer Region – Ядрышко-

Образующие Районы – ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) – применяется для выявления ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах всех акроцентрических хромосом.

Метод дифференциального окрашивания сестринских хроматид выявляет различия между нормальными и измененными клетками при ряде наследственных заболеваний, между механизмами обменов, позволяет использовать частоту СХО как тест на мутагенную активность физических факторов и химических соединений, включая лекарственные препараты.

Метод дифференциального окрашивания хроматид с помощью бромдезоксиуридина (БУДР), являющегося аналогом тимина позволяет идентифицировать различные типы сегментов (блоки) хромосом.

Определение полового хроматина

В соматических клетках женщин половой хроматин выявляется в виде гетерохроматина – небольшой, хорошо окрашиваемой структуры округлой формы размером 0,8-1,1 мкм, находящейся возле ядерной мембраны. Ее также называют тельцем Барра. Половой гетерохроматин – это одна из Х-хромосом,

находящаяся в неактивном (суперспирализованном) состоянии. Количество телец Барра в клетках всегда на одно меньше, чем число Х-хромосом. То есть только одна Х-хромосома в соматических клетках человека (и мужчины, и

женщины) всегда находится в активном состоянии. В норме женщина имеет две, а мужчина одну Х-хромосому. Х-хромосома значительно больше У-

хромосомы и гораздо богаче генами. В связи с этим «феномен Х-инактивации»

служит механизмом компенсации различий в дозе генов, сцепленных с Х-

хромосомой.

Оценка полового хроматина позволяет предположить нарушение числа половых хромосом быстро (около 1 часа) и недорогим способом.

Обнаруженная аномалия всегда является показанием к кариотипированию.

В качестве клеточного материала для исследования используется эпителий слизистой оболочки щеки (буккальный), который получают путем соскоба с помощью шпателя. Материал распределяется по предметному стеклу и без предварительной обработки окрашивается ацетоарсеином. При микроскопии наличие в ядрах клеток одного тельца Барра означает, что клетки содержат две Х-хромосомы, двух телец Барра – три Х-хромосомы, отсутствие телец Барра свидетельствует о содержании одной Х-хромосмы. Возможности метода позволяют сделать заключение только относительно количества Х-хромосом,

но никак относительно кариотипа и даже общего состава половых хромосом.

Молекулярно-цитогенетические методы

В начале 80-х годов XX столетия широкое распространение получили более совершенные методы дифференциального окрашивания хромосом -

кариотипирование с высоким разрешением, позволяющие анализировать малокомпактизованные хромосомы на стадиях профазы и прометафазы

(профазные и прометафазные методы) и проводить разделение нормального гаплоидного набора хромосом более чем на 2000 структурных элементов

(сегментов).

Благодаря успехам в молекулярной генетике человека разработан принципи-

ально новый метод изучения хромосом - метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH – fluorescent in situ hybridization). Это метод флуоресцентного окрашивания отдельных участков или целых хромосом,

основанный на способности хромосомной ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК (РНК) - зондами на препаратах фиксированных клеток. FISH проводится на цитологических препаратах с метафазными хро-

мосомами или интерфазными ядрами («интерфазная цитогенетика»). Для

этого пригодны любые клетки организма, но наиболее часто используются лимфоциты периферической крови, клетки буккального эпителия,

фибробласты кожи, клетки ворсин хориона и амниотической жидкости.

Принцип этого метода состоит в следующем.

1. Для изучаемой хромосомы или конкретного ее участка, исходя из специ-

фичности последовательности оснований ДНК, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой

«помеченный» участок ДНК называется зондом.

2.На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

3.Зондом обрабатывают препарат. Так как последовательность оснований ДНК - зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементар-

ны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК (гибридизация с ДНКзондом).

4. После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединится к биотину или к дигоксигенину. Для биотина таким веществом является стрептовидин. для дигоксигенина - антидигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители.

5. С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных.

Метод позволяет определить местоположение последовательности ДНК или РНК в клетке, клеточном ядре или на хромосомах. FISH используют для выявления анеуплоидий, структурных хромосомных нарушений разных типов

- транслокаций, инсерций, микроделеций и микродупликаций, идентификации дополнительных маркерных хромосом; уточнения сложных комплексных структурных перестроек; физического картирования генов. В настоящее время существует большое количество разнообразных методов FISH: супрессионная гибридизация in situ, мультицветная FISH, сравнительная геномная

гибридизация, спектральное кариотипирование и др.

Сравнительная геномная гибридизация (от англ. Comparative Genomic Hybridization - CGH) используется для картирования и клонирования генов,

вовлеченных в канцерогенез. Этот метод также основан на гибридизации комплементарных ДНКзондов с маркировкой флуорохромами и последующей оценкой свечения. В качестве зондов используется весь геном обследуемого человека. Метод позволяет определить районы хромосом,

которые делетируются или амплифицируются в определенном типе опухоли:

районы делеции – супрессоры опухолевого роста, районы амплификации содержат онкогены. Осуществляется компьютерный анализ хромосом.

Спектроскопический анализ хромосом или спектральное кариотипирование

(от англ. Spectral Kariotyping - SKY) – мечение полной геномной библиотеки с использованием 5 флюорохромов. Каждая пара хромосом имеет уникальные спектральные характеристики. Детекция гибридизационных сигналов проводится с помощью аппарата интерферометра, который позволяет непосредственно на каждой точке поверхности анализировать соотношение интенсивности свечения всех 5 флюорохромов. Далее осуществляется компьютерная обработка результатов. Результат в виде цветового изображения в цифровой форме, при этом гомологичные хромосомы – одного цвета,

перестройки – незначительные изменения спектра.

Показания для проведения цитогенетического обследования

1)Подозрение на хромосомную болезнь на основании клинической симптоматики.

2)Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не от-

носящихся к генным синдромам.

3) В анамнезе у женщины многократные спонтанные аборты (2 и более),

мертворождения или рождение детей с ВПР.

4) Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у мужчины или жен-

щины (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

5) Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.