Praktikum-BH-1

Учебная литература для студентов медицинских вузов

БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

под общей редакцией профессора АГМУ Д.М.Никулиной

Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия

для студентов медицинских вузов

Астрахань - 2009

УДК 577.1(076) ББК 28.902

Б63

Рецензенты: А.А.Терентьев, профессор, доктор медицинских наук, зав. кафедрой биохимии Российского государственного медицинского университета; И.Г.Харитоненков, доктор биологических наук, профессор кафедры биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Б63 Биохимический практикум:

Учеб. пособие /Под ред. Д.М.Никулиной. – Астрахань, 2009.- 145 с. Дополнительный тираж.

Ответственный редактор доцент Т.Б.Воробьева

В подготовке учебно-методического пособия по разделам принимали участие преподаватели кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА кбн Ю.Е. Рагозин, кмн М.А. Чишиева, П.А. Иванов, А.П.Шульгина.

Учебно-методическое пособие содержит необходимую информацию для выполнения студентами аудиторной работы по плану лабораторных, семинарских занятий и коллоквиумов по биологической химии.

ББК 28.902

Коллектив авторов, 2002Астраханская государственная

медицинская академия

Все права авторов защищены. Ни одну часть этого издания нельзя воспроизводить любым способом без предварительного письменного разрешения издателя.

П Р А В И Л А

2

ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ПРИ РАБОТЕ В ЛАБОРАТОРИЯХ

1.К работе в лабораториях допускаются студенты, прошедшие инструктаж по работе с реактивами и биопсийными материалами.

2.В лабораториях кафедры разрешается работать только в халате с длинными рукавами. Длинные волосы должны быть подобраны.

3.Все процедуры при выполнении работ по приготовлению препаратов, отмериванию реактивов (их переливание) должны проводиться только на своём рабочем месте на столе (или в вытяжном шкафу). Нагревание реактивов открытым огнём производится в специально оборудованном вытяжном шкафу. Запрещается проводить какие-либо манипуляции с реактивами над полом.

4.Необходимо соблюдать большую осторожность при работе с крепкими кислотами и щелочами (10% и выше). Особая аккуратность и осторожность необходимы при работе с концентрированными кислотами и щелочами, а также с другими агрессивными веществами (уксусный ангидрид, фенол, пергидроль и др.). Запрещается отмеривать такие реактивы путём подсасывания их ртом во избежание химического ожога полости рта. Отмеривание таких реактивов необходимо производить с помощью сифона или пипетки. Следует остерегаться попадания указанных реактивов на кожу (ожоги) и на одежду (разъедание тканей). Работу с этими веществами следует проводить в резиновых перчатках. При разбавлении крепких кислот для предупреждения разбрызгивания следует добавлять кислоту в воду, а не наоборот.

5.Пролитую щелочь надо засыпать песком или опилками. Затем песок или опилки убрать и это место залить сильно разбавленной кислотой (соляной, уксусной).

Пролитую кислоту следует засыпать песком (опилками нельзя), затем песок убрать лопатой и засыпать содой, потом удалить соду и промыть это место большим количеством воды (в резиновых перчатках).

3

6.При нагревании пробирок в пламени горелки возможно бурное вскипание и выброс содержимого на расстояние до 2-3 м, что особенно опасно в случае попадания кипящих брызг в лицо и глаза. Для предупреждения подобных случаев нагревание пробирок следует проводить у мениска жидкости, а не у дна, непрерывно вращая их и периодически вынимая из пламени. Надо следить, чтобы отверстие пробирки не было направлено на себя или на кого-нибудь из находящихся в лаборатории. Нельзя закрывать горячий раствор пробкой до полного остывания.

7.При сжигании (минерализации) органических веществ в колбах Къельдаля, при гидролизе белка, при анализе мочи, при работе с фенолом, уксусным ангидридом, хлористым бензолом, нитробензолом, анилином и другими подобными веществами в воздухе накапливаются раздражающие пары. Все указанные работы необходимо проводить в вытяжном шкафу.

9.Нельзя оставлять без присмотра горящие спиртовки. Запрещается держать вблизи открытого огня вату, марлю, спирт

идругие легко воспламеняющиеся вещества.

10.При работе с центрифугой необходимо плотно закрывать крышку и запирать её на замок. Увеличивать скорость вращения можно лишь постепенно. Открывать крышку разрешается только после полной остановки ротора.

11.К работе на электромедицинской аппаратуре допускаются лица, изучившие инструкцию по безопасным приёмам работы, приложенную к аппарату.

Запрещается работать на аппаратуре, имеющей электрический пробой, нарушенную проводку, не имеющую заземления (кроме гальванической доски и низковольтной аппаратуры - 24вольтовой сети).

При прекращении подачи электрического тока необходимо выключить все электроприборы.

12.Все вопросы по технике безопасности, возникающие в процессе работы, следует немедленно выяснить у преподавателя или лаборанта.

4

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ

I. Теоретическая часть.

I.1.Контроль исходного уровня знаний. I.2.Обсуждение основных вопросов темы. I.3.Тестовый контроль.

II. Практическая часть.

II.1.Выполнение лабораторных работ. II.2.Самостоятельная работа с методическим

материалом.

II.3.Оформление результатов работы.

III. Заключительная часть.

III.1.Анализ полученных результатов. III.2.Индивидуальный отчет по лабораторной работе. III.3.Задание к следующему занятию. III.4.Индивидуальная работа преподавателя со

студентами.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

I. ЛИТЕРАТУРА

а) обязательная

1. Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин //Биологическая химия. М.: Медицина, 2002.

б) дополнительная

1.Т.Л.Алейникова, Г.В.Рубцова, Н.А.Павлова //Руководство к практическим занятиям по биохимии.М.:Медицина,

2000.-126с.

2.Биохимия. //Под ред. Е.С.Северина. М.,Геотар-мед,

2003.-779с.

3.Горбунова В.Н., Баранов В.С. //Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Петербург:«Спец. лит-ра», 1997.-286с.

4.Климов А.Н., Никульчева Н.Г. //Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. С.-Петербург:«Питер», 1999.-505с.

5.Кольман Я., Рем К.-Г. //Наглядная биохимия. М.: Мир,

2000.-470с.

6.Крю Ж. // Биохимия. Медицинские и биохимические аспекты. М.: Медицина, 1979.

7.Ленинджер А. //Основы биохимии. М.: Мир, 1985.- т.I -

5

III.

8. Марри Р. и др. //Биохимия человека. М.: Мир, 1993.-

тт.I, II.

9. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //Под ред.С.Херрингтона и Дж.Макги.М.: Мир, 1999.-560с.

10. Мецлер Д. //Биохимия. М.: Мир, 1980.- тт.I - III.

11. Николаев А.Я. //Биологическая химия. М.:Высшая шко-

ла, 1998.

12. Пустовалова Л.М.//Практикум по биохимии. Ростов на Дону: Изд-во Феникс, 1999.-544с.

13. Сборник тестов и задач по биохимии. //Под ред. акад. И.П.Ашмарина. М.: Изд-во МГУ, 1996.234с.

14. Страйер Л. //Биохимия. М.: Мир, 1984.-тт.I - III.

15. Строев Е.А. //Биологическая химия. М.: Высшая шко-

ла,1989.

16. Уайт А. и др. //Основы биохимии. М.: Мир, 1981.-тт.I -

III.

17.Щербак И.Г. //Биологическая химия. С-Пб.: Изд-во СПбГМУ, 2005.-480с.

18.Элементы патологической физиологии и биохимии. //Под ред акад. И.П.Ашмарина. М.:Изд-во МГУ, 1997. – 237с.

19.Эллиот В., Эллиот Д. //Биохимия и молекулярная биология. М.:Изд-во НИИ Биомед.химии РАМН, 1999.-373с.

II.КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ

III. МЕТОДИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ: тематические папки,

таблицы, плакаты и пр.

6

КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ

Студенту выставляется оценка:

ОТЛИЧНО - при глубоком знании программного материала, продемонстрированном: а) исчерпывающим ответом; б) грамотным свободным владением теорией при решении ло-

гических задач и практических заданий; в) знакомством с дополнительной литературой.

ХОРОШО - при твердом знании и грамотном изложении программного материала, отсутствии существенных неточностей в ответе, правильном применении теоретических положений в решении практических вопросов и задач.

УДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при знании только основных положений программного материала и недостаточном усвоении его деталей, характеризующимся неточностями формулировок, недостаточно грамотным и последовательным ответом, затруднением в решении задач.

НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при отсутствии знаний по значительной части программного материала, при существенных ошибках в ответе, неумении использовать теоретический материал при решении логических задач.

7

Ч А С Т Ь П Е Р В А Я

ОБЩИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ

РАЗДЕЛ I. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Занятие № 1

ТЕМА. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ФИЗИКО-ХИМИ- ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

Цель занятия:

1.Повторить физико-химические и изучить биологические свойства белков.

2.Ознакомиться с методикой выделения белков.

3.Усвоить принцип разделения белков на фракции методом высаливания.

Исходный уровень знаний:

-кислоты и основания в органической химии;

-химические свойства карбоксильной группы;

-механизм нуклеофильного замещения у тригонального атома углерода;

-химические свойства аминогруппы: основность и нуклеофильность;

-строение, амфотерность и растворимость аминокислот;

-коллоидные растворы и их свойства.

Содержание занятия.

I.2. Элементарный состав белков.

Классификация и номенклатура аминокислот, входящих в состав белков.

Функции белков.

Характерные физико-химические свойства белков. Методы выделения и очистки белков.

8

II.1. Работа: ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Высаливание - это осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2 SO4 и др.

Принцип метода.

Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется определенная концентрация одних и тех же солей. При высаливании белок обычно не теряет своих нативных свойств. Он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковую смесь на фракции, а именно: белки сыворотки крови - на альбумины (А) и глобулины (Г). Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, высаливаются в полунасыщенном (50%), а альбумины - в насыщенном (100%) растворе сернокислого аммония.

Хлористый натрий осаждает глобулины при полном насыщении (100%) раствора, а для осаждения альбуминов требуется еще и его подкисление.

Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка опять может раствориться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.

Для определения белка в растворе используется универсальная биуретовая реакция.

Химизм биуретовой реакции. Биуретовая реакция выявляет в белке пептидную ( -CO-NH- ) связь. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты его неполного гидролиза (пептоны) - розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка. В щелочной среде лактимные формы образуются из лактамных форм. Биуретовая реакция схематично протекает так:

H2N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH- .....

ПРИМЕЧАНИЕ: при постановке биуретовой реакции нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий оса-

док гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание

10