Praktikum-BH-1

слота, кровь, желчные пигменты. В клинике часто определяют эти вещества с помощью специальных реакций.

При ахлоргидрии наряду с молочной кислотой образуются летучие жирные кислоты (уксусная, масляная), т.к. под влиянием микроорганизмов в желудке развиваются процессы брожения. Кровь (кровя-

ные пигменты) может попадать в желудочный сок при изъязвлении стенок желудка. Желчные пигменты появляются в желудке из двенадцатиперстной кишки вследствие антиперистальтики.

а) Обнаружение молочной кислоты.

Принцип метода и химизм реакции см. зан..№20, (с.73). Порядок выполнения работы.

К 1 мл реактива Уффельмана добавить 5 кап желудочного сока, содержащего молочную кислоту.

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Бензидиновая проба на кровь. Принцип метода и химизм реакции.

Реакция обусловлена способностью гемоглобина катализировать окисление бензидина перекисью водорода. Бензидин при этом окисляется в парахинондиимин и жидкость приобретает синюю ок-

раску, а при стоянии - красную. Эта реакция очень чувствительна и служит для определения минимальных примесей крови в биологических жидкостях.

Hb

Порядок выполнения работы.

К 5 кап. бензидина прилить 5 кап. 3% раствора перекиси водорода и 5 кап. желудочного сока, содержащего кровь. Отметить окраску.

РЕЗУЛЬТАТ:

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОТНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.

При определении кислотности желудочного сока различают общую кислотность, общую соляную кислоту, свободную соляную кислоту и связанную соляную кислоту. Под общей кислотностью же-

91

лудочного сока понимают сумму всех кислореагирующих веществ. Принцип метода.

Общую кислотность измеряют в миллилитрах 0,1 N раствора NaOH, затраченного на нейтрализацию 1000 мл желудочного сока в присутствии индикатора фенолфталеина (зона перехода 8,3-10,0; ниже 8,3 - бесцветный, выше 10,0 - красный). Содержание свободной HCl измеряют в мл 0,1 N раствора NaOH, затраченного на нейтрализацию 1000 мл желудочного сока в присутствии индикатора диметиламиноазобензола (зона перехода рН 2,9-4,0; ниже - розовокрасный, выше - желтый).

Соляная кислота, называемая "связанной", находится в соле-

образном состоянии с белками и продуктами их переваривания. Определяется путём расчёта при титровании желудочного сока в присут-

ствии двух индикаторов (диметиламиноазобензола и фенолфталеина).

Общая соляная кислота - сумма свободной и связанной соляной кислоты.

В норме у взрослого человека показатели кислотности колеблются в следующих пределах:

1 кап. диметиламиноазобензола и 2 кап. фенолфталеина. При наличии в желудочном соке свободной HCl он окрашивается в красный цвет с розовым оттенком, при отсутствии ее сразу появляется желтая окраска.

Титровать свободную HCl 0,1 N раствором щелочи из микробюретки до появления желтовато-красного (оранжевого) окрашивания, результат зафиксировать (n1).

Продолжить титрование, не добавляя щелочи в бюретку до появления лимонно-желтого цвета, результат записать (n2).

Продолжить титрование до появления розового окрашивания

(n3).

NB! n3 > n2 > n1.

Расчет:

n • 1000 • 0,1

X = ------------------------ , где

5

92

X - кислотность желудочного сока;

n - количество щелочи, пошедшей на титрование желудочного сока. NB! n=n1 - для определения свободной соляной кислоты;

n=n3 - для определения общей кислотности; n=(n2+n3):2 - для определения общей соляной кислоты. 1000 - количество мл желудочного сока для расчета; 0,1 - кол-во мг-экв щелочи в 1 мл 0,1 N р-ра в ммоль;

5 - кол-во желудочного сока, взятого для титрования в мл. РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

При заболеваниях желудка кислотность может изменяться. При язвенной болезни желудка или гиперацидном гастрите содержание свободной HCl и общей кислотности увеличивается (гиперхлоргидрия). При гипацидном гастрите или раке желудка наблюдается уменьшение количества свободной HCl и общей кислотности (гипохлоргидрия). При раке желудка, хроническом гастрите отмечается полное отсутствие HCl и значительное снижение общей кислотности (ахлоргидрия). При злокачественном малокровии, при раке желудка наблюдается полное отсутствие HCl и пепсина (ахилия).

Работа в плане УИРС.

Получить у преподавателя две пробирки с клиническим материалом. Содержимое 1-ой пробирки проанализировать на содержание патологических компонентов, а образец из 2-ой пробирки оттитровать для определения показателей кислотности желудочного сока. РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы. Что такое желудочный сок?

93

Каков его состав в норме?

Какова роль HCl желудочного сока в пищеварении?

Какие патологические компоненты можно обнаружить в желудочном соке?

Какой реакцией открывают молочную кислоту? Какая проба используется для выявления крови?

Чему в норме равны показатели кислотности желудочного сока? Как называются состояния изменения кислотности?

Материал для самоподготовки. а)1 с.409-431; II, III

Занятие № 28

ТЕМА. ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ, ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ, ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ. СУДЬБА -КЕТОКИСЛОТ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Цель занятия: 1.Изучить общие пути метаболизма аминокислот (дез-, трансаминирование, декарбоксилирование).

2.Овладеть методами качественного и количественного определения белков в моче.

Исходный уровень знаний:

-химия аминокислот;

-реакции дезаминирования, декарбоксилирования;

-классификация и номенклатура ферментов;

-строение витаминов В2,РР,В6 и содержащих их коферментов. Содержание занятия.

I.2. Общие пути метаболизма аминокислот. Механизм поступления аминокислот в клетку. Дезаминирование аминокислот и его виды.

Трансаминирование аминокислот: механизм, ферменты, роль витамина

В6.

Декарбоксилирование аминокислот и его виды.

Биогенные амины: строение, биологическая роль, инактивация.

II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА БЕЛОК

ВМОЧЕ.

Внорме белок в моче находится в следовых количествах, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. При ряде заболеваний с мочой выделяется заметное количество белка, начиная с долей грамма до 25 г в сутки. Появление

94

белка в моче называется протеинурией или альбуминурией, поскольку моча содержит, в основном, сывороточный альбумин.

Протеинурия может быть истинной и ложной. При истинной (или почечной) протеинурии белок сыворотки крови попадает в мочу через почки. Случайная (или ложная) протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя, но не из почек, а из мочевыводящих путей.

Принцип метода.

Для обнаружения белка в моче применяют реакции осаждения с помощью азотной или сульфосалициловой кислот. Последняя - самая чувствительная.

Порядок выполнения работы.

К 1 мл мочи прилить 3 кап 20% раствора сульфосалициловой кислоты.

РЕЗУЛЬТАТ:

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В МОЧЕ ПО МЕТОДУ БРАНДБЕРГА-РОБЕРТСА- СТОЛЬНИКОВА.

Принцип метода.

Метод основан на реакции Геллера с концентрированной азотной кислотой. Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,033% белка (т.е. 0,033 г/л), дают мутное белое колечко в конце 2-й - начале 3-й минуты после наслаивания раствора белка на азотную кислоту. Толщина и быстрота появления кольца зависит от количества белка.

Порядок выполнения работы.

В пробирку налить 1 мл 50% раствора азотной кислоты, туда же осторожно по стенке добавить из пипетки 1 мл мочи. За счет меньшей относительной плотности моча наслаивается на кислоту. Если кольцо появилось сразу, повторить реакцию с мочой, разведенной в 10, 20, 30 и более раз до получения отрицательного результата.

РАСЧЕТ. Количество белка (Х) определяют по формуле Х= n • 0,033 г/л, где

n - разведение мочи.

РЕЗУЛЬТАТ:

95

III.2. Контрольные вопросы.

Как можно открыть белок в моче?

Каков принцип количественного определения белка в моче? Какие виды протеинурии Вы знаете?

Материал для самоподготовки. а)1 с.431-451; II, III

Занятие № 29

ТЕМА. ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА В ОРГАНИЗМЕ. ОРНИТИНОВЫЙ ЦИКЛ МОЧЕВИНООБРАЗОВАНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Цель занятия: 1.Изучить пути образования и обезвреживания аммиака.

2.Освоить методы количественного определения мочевины и остаточного азота в сыворотке крови.

Исходный уровень знаний:

-химия аминокислот;

-реакции дез-, трансаминирования аминокислот;

-классификация и номенклатура ферментов;

-строение витаминов В2, РР, В6 и содержащих их коферментов. Содержание занятия.

I.2.Пути образования и обезвреживания аммиака в организме. Способы обезвреживания аммиака.

Синтез мочевины: химизм, ферменты, нарушения.

II.1.Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕ-ВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (набор "Биотест")

Принцип метода.

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe3+ в сильнокислой среде красный комплекс, который фотометрируют.

Порядок выполнения работы.

Приготовить рабочий раствор, смешав одну долю раствора Реактива с одной долей раствора серной кислоты.

Осадить сывороточные белки: в центрифужную пробирку на-

96

лить 1мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавить 0,1 мл сыворотки и центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин. Для анализа использовать супернатант.

Так же разбавить эталонный раствор: к 1мл 5% раствора ТХУ добавить 0,1 мл эталонного раствора мочевины.

Пробирки закрыть крышкой из фольги и нагреть точно 10 мин на кипящей водяной бане, охладить (2-3мин) в струе холодной воды и не позже, чем через 15 мин измерить оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 1 см при 490-540 нм (светофильтр №5, зеленый).

РАСЧЕТ. Концентрацию мочевины (Х) рассчитывают по формуле:

А

Х= ― • 16,65 ммоль/л, где

В

А - оптическая плотность пробы, В - оптическая плотность эталона.

Можно сделать перерасчет мочевины в азот мочевины умножением на коэффициент 0,466.

Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови составляет 2,50-8,32 ммоль/л; в моче - 333-583 ммоль/сут.

Верхняя граница содержания мочевины зависит от приема белков с пищей. При приеме белков более 2,5 г/кг веса в сутки содержание мочевины в сыворотке может быть до 10 ммоль/л.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО АЗОТА ПО МЕТОДУ АССЕЛЯ.

Наряду с белками в крови содержатся азотсодержащие вещест-

97

ва небелкового характера. После удаления белков крови осаждением безбелковый фильтрат содержит еще азот, носящий название "остаточного азота" и слагающийся из азота мочевины, мочевой кислоты, креатина, креатинина, индикана, аминокислот и других веществ.

Принцип метода.

Безбелковый фильтрат минерализуется в присутствии серной кислоты и пергидроля. При этом весь азот органических соединений превращается в сернокислый аммоний, который определяется колориметрически с реактивом Несслера.

Порядок выполнения работы.

Впробирку отмерить 2,8 мл фосфорномолибденового реактива, добавить микропипеткой 0,2 мл крови, взболтать и оставить на 30 мин. Осадок белка отфильтровать. К 1 мл фильтрата прилить 0,05мл (2 кап) концентрированной серной кислоты. Во 2-ую пробирку поместить 2

кап концентрированной H2SO4 и содержимое обеих пробирок сжечь на песочной бане (При нагревании жидкость в 1 пробирке буреет). Обе пробирки снять с огня, остудить, добавить по 2-3 кап. пергидроля и снова нагреть до полного обесцвечивания. После сжигания пробирки охладить и прибавить по 10 мл воды, 0,2 мл 50% раствора NaOH и 0,5 мл реактива Несслера. Испытуемая жидкость окрашивается в желтый цвет.

Вконтрольную пробирку прилить из микробюретки стандартный раствор сернокислого аммония по каплям до получения одинаковой окраски с опытным раствором. Количество раствора зафиксировать.

РАСЧЕТ. Количество остаточного азота вычисляют по формуле:

а • 0,05 • 100

0,067

а - кол-во мл стандартного раствора, пошедшего на титрование; 0,05 - количество азота в 1 мл стандартного раствора в мг; 0,067 - количество крови, взятой для сжигания (одна треть от 0,2 мл крови, взятой для осаждения белков).

РЕЗУЛЬТАТ:

98

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Каково нормальное содержание мочевины в крови? в моче? В каких случаях содержание мочевины в крови повышается?

О чем свидетельствует снижение содержания мочевины в крови? Что такое "остаточный азот"?

Каково нормальное количество остаточного азота в крови? Что такое азотемия и когда наблюдается?

Материал для самоподготовки. а)1 с.431-451; II, III

Занятие № 30

ТЕМА. ОБЩАЯ СХЕМА ИСТОЧНИКОВ И ПУТЕЙ УТИЛИ-ЗАЦИИ АМИНОКИСЛОТ В ТКАНЯХ. КАТЕПСИНЫ. СПЕ-ЦИФИЧЕСКИЕ ПУТИ ОБМЕНА НЕКОТОРЫХ АМИНОКИСЛОТ. ПАТОЛОГИЯ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.

Цель занятия: 1.Изучить специфические пути обмена отдельных аминокислот.

2.Знать физиологическое значение метаболитов - производных аминокислот.

3.Ознакомиться с патологией азотистого обмена.

4.Овладеть методами определения продуктов азотистого обмена в крови и моче.

Исходный уровень знаний:

-химия аминокислот;

-заменимые и незаменимые аминокислоты;

-универсальные пути катаболизма аминокислот;

-витамины РР, ВС: строение, биологическая роль. Содержание занятия.

I.2. Обмен глицина и серина: взаимопревращения, роль ТГФК. Обмен серосодержащих аминокислот: взаимопревращения, особенности дезаминирования, синтез креатинина, глутатиона.

Обмен фенилаланина и тирозина: распад до фумаровой и ацетоуксусной кислот, синтез катехоламинов, тиронинов, меланина.

Обмен триптофана: серотониновый и кинурениновый пути. Схема утилизации дикарбоновых аминокислот.

99

Врожденные и вторичные нарушения азотистого обмена.

II.1. Работа № 1. ОТКРЫТИЕ КРЕАТИНИНА В МОЧЕ.

Креатинин образуется из креатина или фосфокреатина путем отщепления фосфорной кислоты и выделяется с мочой в количестве около 2 г/сут.

Принцип метода.

Наиболее характерными реакциями для креатинина являются реакция образования нестойкого нитрозокреатинина (красного цвета) и реакция образования хорошо растворимой соли пикрата креатинина, окрашенной в оранжево-красный цвет.

Порядок выполнения работы. а) Нитропруссидная проба.

К 1 мл мочи добавить 0,5 мл 10% раствора едкого натра и 0,5 мл нитропруссида натрия. Отметить окраску. После добавления уксусной кислоты окраска быстро исчезает.

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Реакция с пикриновой кислотой.

К1 мл мочи добавить 10 кап 10% раствора пикриновой кислоты

истолько же 10% раствора едкого натра.

РЕЗУЛЬТАТ:

Работа № 4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРЕАТИНИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (БИОТЕСТ).

Принцип метода.

В щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинирования, в моче - после разведения водой. Определение не совсем специфично

Порядок выполнения работы.