Praktikum-BH-1

Порядок выполнения работы.

К 10 каплям гидролизата прилить 20 капель молибденового реактива и кипятить несколько минут. При этом жидкость (не осадок) окрашивается в лимонно-желтый цвет. Пробирку охладить в струе холодной воды.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОДЫ:

III.2. Контрольные вопросы. Что такое нуклеопротеиды?

В каких тканях содержится много нуклеопротеидов? Укажите продукты гидролиза нуклеопротеидов.

Какие белки входят в состав нуклеопротеидов? Укажите их особенности.

Какие качественные реакции на продукты гидролиза нуклеопротеидов Вы знаете?

Материал для самоподготовки: I а)1. с. 86-88, 96-113; II; III.

Занятие № 14

ТЕМА. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Цель занятия: Ознакомиться с этапами синтеза нуклеиновых кислот в живых организмах.

Исходный уровень знаний:

-строение и функции нуклеиновых кислот;

-репликация, связь с клеточным циклом;

-понятие о транскрипции.

Содержание занятия.

I.2. Синтез ДНК: этапы, механизм, значение. Повреждения и репарация ДНК.

Механизм транскрипции.

Понятие о мозаичной структуре генов, первичном транскриптоне. Посттранскрипционная достройка РНК.

51

I.3. Контрольная работа.

СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ ПО РАЗДЕЛУ «СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ»

1.Строение (в виде лактам-лактимных таутомеров) пиримидиновых и пуриновых нуклеиновых оснований. Комплементарность оснований. Минорные азотистые основания.

2.Строение N-гликозидов (нуклеозидов) Д-рибозы и 2- дезокси-Д-рибозы с нуклеиновыми основаниями и реакции их гидролиза. Псевдонуклеозиды.

3.Строение нуклеотидов, входящих в ДНК (дезоксиадениловой, дезоксигуаниловой, дезоксицитидиловой, тимидиловой кислот) и в РНК (адениловой, уридиловой, гуаниловой, цитидиловой кислот). Схемы неполного и полного гидролиза этих мононуклеотидов.

4.Строение дифосфо- и трифосфонуклеотидов, схемы их неполного и полного гидролиза.

5.Схемы неполного и полного гидролиза нуклеиновых

кислот.

6.Первичная структура нуклеиновых кислот. Строение участков ДНК (строение триплетов, например, ТГА, АЦГ, ЦТА

ит.п.).

7.Вторичная и третичная структура нуклеиновых кислот. Различие состава и структуры ДНК и РНК.

8.Комплементарные полинуклеотидные цепи. Модель двойной спирали.

9.Функции ДНК и РНК. Типы РНК.

10.Строение участков РНК с последовательностью оснований: УГА, АУГ, ЦУГ и т.п.

11. Строение фрагментов мРНК, полученных при транскрипции с ТЦА, ГТА, АЦТ и т. п.

12. Особенности структуры и специфичность транспортной РНК.

13. Строение антикодонов тРНК, соответствующих кодонам АУГ, ЦУА, УАГ и т. п.

II.1. Работа № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБО-

52

НУКЛЕОТИДОВ ИЗ СЕЛЕЗЁНКИ

Дезоксирибонуклеопротеиды выделяют из богатых клеточными ядрами тканей: зобной железы, селезёнки и др. В работе используется готовый раствор дезоксирибонуклеопротеидов, в котором определяют наличие белка (биуретовая реакция) и ДНК.

а) Биуретовая реакция проводится так же, как описано в работе №1 (занятие № 1).

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Реакция на ДНК. Химизм реакции.

При нагревании ДНК гидролизуется и освободившаяся дезоксирибоза в реакции с дифениламином даёт синее окрашивание.

Порядок выполнения работы.

К 15-20 кап. раствора добавить равный объём дифениламина. Смесь нагреть в кипящей водяной бане в течение 15 минут.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Материал для самоподготовки. I а)1. с. 86-88, 96-113, 478-498; II; III.

Занятие № 15

СЕМИНАР ПО ТЕМЕ: "БИОСИНТЕЗ БЕЛКА. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА У ПРО- И ЭУКАРИОТОВ"

Цель занятия: 1.Закрепить знания этапов репликации и транскрипции, роли ДНК- и РНК-полимераз.

2.Усвоить механизм трансляции и регуляции биосинтеза белка.

53

Исходный уровень знаний:

-виды нуклеиновых кислот;

-строение и функция ДНК;

-строение и функции различных типов РНК;

-биосинтез нуклеиновых кислот. Содержание занятия.

I.2. Обсуждение устных сообщений студентов.

ТЕМЫ ДОКЛАДОВ К СЕМИНАРУ

1.История изучения и общая схема синтеза белка.

2.Генетический код: кодирующие элементы, свойства.

3.Движение генетической информации. Матричный синтез РНК. РНК-полимеразы. Обратные транскриптазы.

4.Активирование аминокислот и транспорт их к месту синтеза белка. Роль т-РНК как адаптора между нуклеотидами и аминокислотами.

5.Этапы синтеза белка. Строение рибосом, функционирование полирибосом.

6.Механизмы трансляции и синтеза полипептидной цепи: инициация и элонгация упорядоченной расстановки аминокислот.

7.Терминация синтеза белка, формирование вторичной, третичной и четвертичной структур.

8.Регуляция синтеза белка у прокариотов. Теория Ф.Жакоба и Ж.Моно.

9.Регуляция синтеза белка у эукариотов. Гипотеза Г.П. Георгиева.

10.Молекулярные мутации и наследственные болезни.

Материал для самоподготовки. I а)1. с. 509-544; II; III.

Список дополнительной литературы.

1.БРОДСКИЙ В.Я. и НЕЧАЕВА Н.В.//Ритм синтеза бел-

ка. М.: Наука,1988.-239с.

2.ЗЕНГБУШ П.//Молекулярная и клеточная биология. В

54

3-х томах. М.: Мир.-1982.

3.ЗЕНГЕР В.//Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.:Мир.-1987.-584с.

4.КИСЕЛЕВ Л.Л.//Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-т-РНК.М.:Наука.-1984.-408с.

5.Р.МАРРИ, Д.ГРЕННЕР, П.МЕЙЕЛ, В.РОДУЭЛЛ. //Биохимия человека. В 2-х томах. М.: Мир,1993.

6.СИНГЕР М., БЕРГ П. //Гены и геномы. М.: Мир, 1998.-

тт.I,II.-392с.

7.СПИРИН А.С.//Структура рибосом и синтез белка. Пущино,ОНТИ НЦБИ,1984.-367с.

8.ФЕДОРОВ Н.А.//Структура ДНК и трансформация клеток. М.: Медицина.-1983.-158с.

9.ЭЛЛИОТ В., ЭЛЛИОТ Д. //Биохимия и молекулярная биология. М.: Изд-во НИИ биомед.химии РАМН, 1999.-372с.

Занятие № 16

КОЛЛОКВИУМ: "МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ"

Вопросы к коллоквиуму

1.Нуклеиновые основания. Лактим-лактамная таутомерия.

2.Минорные основания, их таутомерные формы. Псевдонуклеозиды.

3.Нуклеозиды и нуклеотиды. Примеры.

4.Строение нуклеозидмонофосфатов, схемы неполного и полного гидролиза. Циклическая АМФ.

5.Строение нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов, схемы неполного и полного гидролиза. Макроэргические связи.

6.Первичная структура ДНК. Правила Чаргаффа.

7.Вторичная и третичная структура ДНК.

8.Первичная структура и типы РНК, их локализация в

клетке.

9.Особенности строения разных типов РНК. Представления о вторичной и третичной структуре РНК на примере тРНК.

10.Комплементарность гетероциклических оснований

55

(нуклеотидов). Роль водородных связей в формировании вторичной структуры нуклеиновых кислот.

11.Репликация ДНК и фазы клеточного цикла. ДНКполимеразы. Повреждения ДНК и их репарация.

12.Биосинтез РНК (транскрипция). РНК-полимеразы.

13.Природа генетического кода. Постулаты Ф.Крика.

14.Основные компоненты белоксинтезирующей системы

иэтапы синтеза белка. Направление движения генетической информации.

15.Активирование аминокислот (синтез аминоацилтРНК) и транспорт их к месту синтеза белка. тРНК как адаптор. Субстратная специфичность аминоацил-тРНК-синтетазы.

16.Строение и функционирование рибосом и полирибосом.

17.Стадии синтеза белка: инициация трансляции.

18.Стадии синтеза белка: элонгация трансляции.

19.Стадии синтеза белка: терминация трансляции и формирование вторичной, третичной и четвертичной структуры белка.

20.Ингибиторы матричных синтезов: лекарственные препараты, вирусные и бактериальные токсины.

21.Регуляция действия генов. Понятие об оперонах. Репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов (теория Ф.Жакоба и Ж.Моно).

22.Индукция и репрессия синтеза белков в организме человека (у эукариотов). Роль гормонов в регуляции действия генов.

23.Клеточная дифференцировка и онтогенез как результат дифференциальной активности генов. Изменение белкового состава клеток при дифференцировке.

24.Биохимические основы медицинской генетики. Молекулярные механизмы генетической изменчивости: мутации, рекомбинации.

25.Генотипическая гетерогенность популяций и полиморфизм белков на примере гемоглобина и некоторых ферментов.

26.Молекулярные мутации и наследственные болезни. Биохимические методы в диагностике врожденных заболева-

56

ний.

РАЗДЕЛ VI. Б И О Х И М И Я К Р О В И

Занятие № 17

ТЕМА: БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Цель занятия: 1.Знать основные белки плазмы крови, их функции и особенности структуры.

2.Ознакомиться с методами разделения белков. Исходный уровень знаний:

-структура и биологическая роль белков;

-классификация белков;

-различие альбуминов и глобулинов;

-энзимодиагностика.

Содержание занятия.

I.2. Физиологическая роль белков плазмы крови. Характеристика отдельных белков. Понятие о нормо-, гипо- и гиперпротеинемии.

Диспротеинемии, парапротеинемии, дефектопротеинемии. Эмбриоспецифические белки.

II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода.

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди (сульфата меди) в щелочной среде (биуретовый комплекс). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

Порядок выполнения работы:

Осторожно перемешать, оставить на 30 минут в штативе при комнатной температуре.

Фотоколориметрировать при зеленом светофильтре 540 нм против контрольного раствора. Определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации белка (в г/л) она соответствует.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л (6,5-8,5 г%), у детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5г%).

Повышение содержания белка (гиперпротеинемия) наблюдается при ревматизме и миеломной болезни (плазмоцитоме) - до 120-150 г/л. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах.

Понижение уровня белка (гипопротеинемия) имеет место при нефритах, злокачественных опухолях, алиментарной дистрофии.

Работа № 2. ТИМОЛОВАЯ ПРОБА. Принцип метода.

Патологически повышенные -глобулины, -глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови насыщенным

58

тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественных соотношений.

Порядок выполнения работы

Перемешать и выдержать точно 30 минут при комнатной температуре, после этого вновь перемешать и измерить оптическую плотность пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при длине волн 650 нм (светофильтр № 4).

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

Нормальные величины: 0-4 единиц S-H (единицы помутнения по Shank-Hoagland). Повышение тимоловой пробы наиболее характерно для заболеваний печени (ещё до появления желтухи). Патологические величины - более 5 единиц S-H.

Работа № 3. ПРОБА ВЕЛЬТМАНА Принцип метода.

При добавлении к сыворотке раствора хлорида кальция и нагревании происходит нарушение коллоидальной устойчивости сыворотки.

Порядок выполнения работы.

К 0,1 мл сыворотки прибавить 4,9 мл воды, перемешать, опрокидывая пробирку, и прибавить 0,1 мл 0,5% раствора хлорида кальция. Встряхивать и нагревать пробирку над пламенем до однократного закипания смеси. Охладить пробирку и осмотреть на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавить еще 0,1 мл хлорида кальция и вновь прокипятить. Процедуру

59

повторить, пока не выпадут хлопья.

Результаты оценить, подсчитав общее количество пошедшего на реакцию хлорида кальция.

РЕЗУЛЬТАТ: ВЫВОД:

Клинико-диагностическое значение.

В норме коагуляция наступает при прибавлении 0,4-0,5 мл раствора хлорида кальция. Проба Вельтмана снижена при паренхиматозном поражении печени и малярии. Коагуляция при добавлении большего количества раствора хлорида кальция наблюдается при ревматизме, туберкулезе легких.

Все последующие работы демонстрируются преподавате-

лем.

Работа № 4. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ ПО ОУХТЕРЛОНИ

Принцип метода.

При встречной диффузии в агар молекулы антигена и антител реагируют между собой, образуя преципитат. Линия преципитации становится видимой в проходящем луче света, если реагирующие компоненты находятся в оптимальном соотношении. С помощью этого метода можно провести анализ антигенной смеси, т.к. каждая пара антиген-антитело образует свою линию преципитации, и сравнить антигенные компоненты в различных системах.

Рис. 4. Полуколичественный учет результатов анализа. 1-

60