Praktikum-BH-1

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Открытие фруктозодифосфата при помощи реакции Селиванова.

Принцип метода и химизм реакции.

Из фруктозы при нагревании с крепкой соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который дает с резорцином продукт конденсации вишнево-красного цвета.

Окраска зависит от концентрации фруктозодифосфата. РЕЗУЛЬТАТ:

в) Открытие молочной кислоты. Принцип метода и химизм реакции.

Молочная кислота в присутствии фенолята железа (реактив Уффельмана), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета.

71

Порядок выполнения работы.

В пробирку налить 1 мл приготовленного ex tempore реактива Уффельмана (смесь 20 кап. 1% раствора фенола и 2 кап 1% раствора хлорного железа), прибавить 0,5 мл безбелкового фильтрата мышц.

РЕЗУЛЬТАТ:

Работа № 2. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН В1. Витамин В1 еще называется тиамин, т.к. в своей структуре со-

держит серу и азот. Тиаминпирофосфат участвует в окислительном декарбоксилировании -кетокислот и в транскетолазной реакции, входя в состав ферментов.

Недостаток витамина В1 в пище вызывает поражение периферической нервной системы, известное под названием "бери-бери". При этом накапливаются пировиноградная кислота и другие - кетокислоты.

Принцип метода.

В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета (диазореакция).

Порядок выполнения работы.

К диазореактиву, состоящему из 5 кап. 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5 кап. 5% раствора нитрата натрия, добавить 1-2 кап. 5% раствора тиамина, затем по стенке пробирки осторожно наслоить 5-7 кап. 10% раствора бикарбоната натрия. На границе раздела жидкостей отметить появление цветного кольца.

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2. Контрольные вопросы.

Какие реакции гликолиза являются эндэргоническими? Какие реакции гликолиза являются экзэргоническими?

72

Каков энергетический эффект гликолиза (исчисляемый в молекулах АТФ)?

Каков КПД гликолиза?

Какие триозофосфаты образуются в процессе гликолиза? Указать качественную реакцию на триозофосфаты. Указать качественную реакцию на фруктозу.

На чем основано качественное определение тиамина? Каков принцип метода определения молочной кислоты?

Материал для самоподготовки. а) 1. с.327-345; II, III

Занятие № 21

ТЕМА. ПУТИ АЭРОБНОГО ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ. РЕГУЛЯЦИЯ И НАРУШЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ.

Цель занятия: 1.Изучить аэробные пути окисления глюкозы.

2. Ознакомиться с регуляцией и патологией углеводного обмена.

3.Овладеть методом количественного определения глюкозы крови. Исходный уровень знаний:

-химия моносахаридов;

-анаэробное окисление глюкозы в организме;

-регуляция активности ферментов;

-пиридинзависимые оксидоредуктазы. Содержание занятия.

I.2. Цикл трикарбоновых кислот.

Пентозофосфатный путь окисления глюкозы: локализация в клетке, химизм окислительной ветви, ферменты, энергетическая ценность, биологическое значение.

Взаимосвязь дихотомического и апотомического путей окисления глюкозы.

Регуляция углеводного обмена: роль ЦНС, желез внутренней секреции, ц-АМФ.

Патология углеводного обмена: причины, симптоматика, примеры энзимопатий.

"Сахарные" кривые, диагностическое значение.

II.1. Лабораторная работа. ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ. Принцип метода и химизм реакции.

73

Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты образует комплекс сине-зеленого цвета, интенсивность кото-

рого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре.

Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови.

Инсулин вырабатывается поджелудочной железой и вызывает снижение уровня глюкозы в крови. Препарат инсулина применяется при лечении сахарного диабета. Особенно чувствительна к снижению уровня сахара в крови ЦНС, т.к. глюкоза является для нее основным источником энергии. Снижение сахара в крови ниже 2,77 ммоль/л (50 мг%) вызывает судороги и может привести к смерти.

Под влиянием инсулина стимулируется синтез гликогена в печени и мышцах, тормозится распад гликогена, глюкоза превращается в липиды, увеличивается проницаемость глюкозы через клеточные мембраны в мышечной и жировой ткани, стимулируется активность гексокиназы (фермент гликолиза), активируется цикл Кребса.

Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.

Адреналин вырабатывается мозговым веществом надпочечников, в высоких концентрациях является сильным ядом. При введении адреналина содержание глюкозы в крови увеличивается, развивается гипергликемия и, если уровень ее достигает 8,88 ммоль/л (160 мг%), появляется глюкозурия. Увеличение содержания глюкозы в крови под действием адреналина объясняется, в первую очередь, усилением в печени распада гликогена до глюкозы.

Порядок выполнения работы.

Определив содержание глюкозы в нескольких пробах крови ортотолуидиновым методом, надо сделать вывод о том, в каком случае кровь получена от интактного животного, после введения кролику инсулина либо адреналина.

74

Измерить оптическую плотность против воды в кювете на 10 мм с

пробе; Сст - концентрация глюкозы в стандартной пробе;

Еоп - оптическая плотность пробы; Ест - оптическая плотность стандарта глюкозы.

Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0555.

Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека,

определяемое данным методом, колеблется в пределах 3,33-5,55

ммоль/л (60-100 мг%).

РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

75

III.2. Контрольные вопросы.

Какие гормоны и почему могут стимулировать гипер-гликемию? Какие гормоны и почему вызывают гипогликемию?

При какой концентрации глюкозы в крови появляется глюкозу-

рия?

Каков характер "сахарной" кривой у здорового человека и больного сахарным диабетом?

Материал для самоподготовки. а)1. с.345-362, 267-272; II, III

Занятие № 22

КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ "ОБМЕН И ФУНКЦИИ УГЛЕВОДОВ"

Вопросы к коллоквиуму.

1.Основные углеводы пищи. Общая характеристика и классификация углеводов. Биологическая роль в организме.

2.Переваривание и всасывание углеводов в желудочно-ки-шечном тракте (особенности углеводного обмена у детей).

3.Глюкоза - важнейший метаболит углеводного обмена. Общая схема источников и путей расходования глюкозы в организме.

4.Структура, свойства, распространение гликогена в тканях как резервного полисахарида. Физиологическое значение мобилизации гликогена, механизм.

5.Биосинтез гликогена и его физиологическое значение. Гликогенозы и агликогенозы.

6.Роль гормонов (адреналина, глюкагона, инсулина), ц-АМФ и протеинкиназ в биосинтезе и мобилизации гликогена.

7.Представления о строении и функциях гликозаминогликанов. Роль гиалуроновой и хондроитинсерной кислот в нормальном функционировании межклеточного вещества и развитии патологических состояний. Значение гепарина в медицинской практике.

8.Последовательность реакций анаэробного распада глюкозы (гликолиз) и гликогена (гликогенолиз). Дальнейшая судьба молочной кислоты.

9.Физиологическое значение гликолиза и его энергетическая ценность. Роль анаэробного распада глюкозы в мышцах.

10.Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кисло-

76

ты.

11.Участие витаминов в процессе образования активного ацетата.

12.Этапы основного аэробного (дихотомического) пути окисления глюкозы, его распространение в организме человека и физиологическое значение.

13.Цикл трикарбоновых кислот: последовательность реакций и характеристика ферментов.

14.Физиологическая роль цикла трикарбоновых кислот. Аллостерический механизм регуляции цикла лимонной кислоты.

15.Энергетический баланс дихотомического пути окисления глюкозы в тканях.

16.Пентозофосфатный (апотомический) путь превращения глюкозы, физиологическое значение. Химизм окислительной ветви и энергетический баланс.

17.Взаимосвязь дихотомического и апотомического путей окисления глюкозы. Соотношение анаэробного и аэробного путей распада глюкозы при мышечной работе и их роль в организме.

18.Глюконеогенез: химизм реакций, характеристика ферментов, биологическая роль.

19.Аллостерические механизмы регуляции гликолиза и глюконеогенеза (АТФ, АДФ, АМФ, НАД, НАДН+ как аллостерические эффекторы).

20.Взаимосвязь гликолиза и глюконеогенеза.

21.Нейрогуморальная регуляция углеводного обмена. Наследственные нарушения углеводного обмена.

22.Роль инсулина в поддержании постоянного уровня сахара в крови. Сахарные кривые, их диагностическое значение.

РАЗДЕЛ VIII. ОБМЕН И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ

Занятие № 23

ТЕМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ ЛИПИДОВ. УЧАСТИЕ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ В ПРОЦЕССЕ УСВОЕНИЯ ЛИПИДОВ.

Цель занятия: 1.Повторить физико-химические свойства и биологическую роль липидов.

2.Знать процессы переваривания и всасывания липидов, роль желчных кислот.

3.Ознакомиться с методами качественного определения желчных

77

кислот и активности липаз. Исходный уровень знаний:

-строение и свойства высших жирных кислот;

-строение и свойства нейтральных жиров;

-строение и свойства сложных липидов;

-биологическая роль липидов;

-классификация и номенклатура ферментов. Содержание занятия.

I.2.Строение и свойства природных высших жирных кислот на примере пальмитиновой, олеиновой, линолевой и других кислот. Классификация липидов.

Физико-химические свойства и биологическое значение триацилглицеринов.

Особенности строения и биологическая роль фосфолипидов. Особенности строения и биологическая роль сфинголипидов. Особенности строения и биологическая роль стероидов.

Переваривание и всасывание липидов. Физиологическое значение желчных кислот.

II.1. Работа № 1. ВЛИЯНИЕ ЖЕЛЧИ НА АКТИВНОСТЬ ЛИПАЗЫ.

Липаза - малоспецифичный фермент, действующий на многие жиры при рН=9,0, гидролитически расщепляющий эфирную связь в - положении (т.е. в крайнем положении).

Принцип метода.

Скорость действия липазы в отдельных порциях молока можно узнать по количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе жира за определенный промежуток времени. Количество жирных кислот (ЖК) определяют титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина. В случае добавления в пробу желчи липаза активируется и гидролиз жиров молока протекает с большей скоростью. Результаты определения выражают в миллилитрах титрованного раствора щелочи. Строят графики, где по оси ординат откладывают количество 0,05 N раствора щелочи в миллилитрах, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, а на оси абсцисс - время в минутах.

Порядок выполнения работы.

Быстро перемешать и поместить в термостат при t=380С

Каждые 15 мин из обеих колб переносить в стаканчики по 1,0 мл смеси и сразу титровать 0,05 N раствором NaОН до слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек. Всего провести 4 определения. По полученным данным построить 2 графика в одной системе координат.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

мл

0,05 N р-р NaOH

ВЫВОД:

Работа № 2. ДЕЙСТВИЕ ФОСФОЛИПАЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

В поджелудочной железе и ее соке содержится несколько фос-

фолипаз - ферментов, ускоряющих гидролиз фосфолипидов, в частности, лецитина. Лецитин под действием фосфолипаз А1, А2, С и D расщепляется на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и холин. Точки приложения действия фосфолипаз на лецитин (фосфатидилхолин):

фосфолипаза А1

79

фосфолипаза А2 СH2-O-CO-R

|

R-CO-О-CH

|

CH2-O-PO-O-CH2-СH2-N(CH3)3

|

OH

фосфолипаза С фосфолипаза Д

Принцип метода.

Об активности фосфолипаз поджелудочной железы судят по появлению свободной фосфорной кислоты, способной образовывать желтый осадок при нагревании с молибдатом аммония.

Порядок выполнения работы.

В две пробирки налить по 5 кап. суспензии яичного желтка. В первую пробирку добавить 2 кап. панкреатина, а во вторую (контроль) - 2 кап. воды. Обе пробирки поместить в термостат при t=380 C на 30 мин. После инкубации в обе пробирки налить по 5 кап. молибденового реактива, нагреть их на пламени горелки и охладить водой под краном. РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

Работа № 3. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ЖЕЛЧНЫЕ КИСЛОТЫ.

Переваривание и всасывание липидов и жирорастворимых витаминов нарушается при воспалении печени, желчного пузыря и при желчнокаменной болезни.

Принцип метода.

Желчные кислоты можно открыть реакцией Петтенкофера. При взаимодействии желчной кислоты с оксиметилфурфуролом, образующимся из тростникового сахара под действием концентрированной серной кислоты, появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Порядок выполнения работы.

80